Tinh sạch protein

Tinh sạch protein I. Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau: 1. Nhận biết protein mục tiêu 2. Ly trích protein từ tế bào 3. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực 4. Phân tách protein bằng điện di trên gel 5. Xác định trọng lượng và khối lượng của protein II. Nhận biết protein mục tiêu Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng. III. Ly trích protein từ tế bào Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta cần phân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiều protein mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sự mày mò qua từng thí nghiệm. Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơn lắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạt tính. Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả. IV. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện. Lượng đáng kể protein tinh sạch, khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ chế phản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký. IV.1. Tủa bằng muối Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Ví dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của một dung dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước. Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách IV.2. Sự thẩm tách Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ. Những phân tử có cấu trức không gian nhất định lớn hơn dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi. Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau. IV.3 Sắc ký Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động. Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy). IV.3.1 Sắc ký lọc gel Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio- gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein IV.3.3 Sắc ký ái lực Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột. Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao. IV.3. Sắc ký lỏng cao áp Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh. V. Phân tách protein bằng điện di trên gel Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di. V.1Điện di một chiều Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này, được đặt tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và các đại phân tử khác như DNA và RNA. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay bất kỳ phân tử nào) trong điện trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực của protein (z) và hệ số ma sát (f) Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi lực kéo của độ nhớt fv tăng lên do sự ma sát giữa phân tử đang chuyển động với môi trường. Lực ma sát phụ thuộc vào cả khối lượng, hình dạng của phân tử đang di chuyển lẫn độ nhớt (η) của môi trường. Với một khối cầu có bán kính là r, ta có Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. điện di được thực hiện trên một bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng điện từ trên xuống. Gel polyacrylamide, được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết chéo của methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì nó có tính trơ về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng. Điện di là một cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích thước, sẽ bị tác động một lực để di chuyển trong cùng một chất nền. Gel ở đây có thể xem tương đương với một hạt trong cột lọc gel. Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein. Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE. Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein. Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ có một băng ngày càng đậm. Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu. V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng điện Các protein còn có thể được phân tách bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid amin có tính acid và số acid amin có tính base của chúng. Điểm đẳng điện của một protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại điểm pH này, tính di động của protein trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì z trong công thức (1) bằng 0. Mỗi một protein có một pI riêng; ví dụ như pI của cytochrome C, một protein vận chuyển ion có tính base cao, là 10.6, trong khi pI của albumin huyết thanh, một protein có tính acid trong máu, là 4.8. Giả định cho một hỗn hợp protein chạy trong điện trường trong một miếng gel với một khuynh độ pH, không có sự hiện diện của SDS. Mỗi protein sẽ di chuyển cho đến khi nó đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện của protein. để tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho vào gel một hỗn hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn hợp này. Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả năng phân biệt được sự chênh lệch pI khoảng 0.01 hay những protein khác nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có thể được phân tách bằng phương pháp này. V.3 Điện di hai chiều Đây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS- PAGE với điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện. sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm gel SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Khả năng phân tách của phương pháp này được chứng minh khi hơn một ngàn protein của vi khuẩn E. coli có thể được phân tách trong một lần chạy điện di. Những protein được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau có thể phân tách được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của tính hiệu sẽ được xác định. Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là có rất nhiều protein được phân tách nhưng lại phân biệt rõ. Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổi. V.4 Đánh giá kết quả tinh sạch protein Sau mỗi bước tinh sạch, những thông số sau cần được ghi nhận để có thể đánh giá quá trình tinh sạch protein: Protein tổng số: lượng protein có trong một phân đoạn. Thông số này tính bằng cách nhân nồng độ một phần của phân đoạn với tổng thể tích của phân đoạn đó. Hoạt tính tổng: hoạt tính của enzyme trong phân đoạn đó. Thông số này được tính bằng cách nhân hoạt tính của enzyme có trong lượng mẫu được xét nghiệm với tổng thể tích của phân đoạn đó. Hoạt tính riêng: bằng hoạt tính tổng chia cho protein tổng số. Yield: hoạt tính còn lại sau mỗi bước tinh sạch được thể hiện bằng phần trăm hoạt tính của dịch chiết thô với hoạt tính trong dịch chiết khởi đầu là 100%. Mức tinh sạch: chỉ mức độ tinh sạch, được tính bằng cách chia hoạt tính riêng, được tính sau mỗi bước tinh sạch, với hoạt tính riêng của dịch chiết ban đầu. Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm. Thật vậy, với kỹ thuật SDS-PAGE, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng protein mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng . Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch phải dựa cả vào 2 thông số mức độ tinh sạch và yield. Một quá trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu (nhiều protein ngoài protein mục tiêu) và làm phức tạp việc giải thích thí nghiệm. VI. Xác định khối lượng của protein Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ thuật dùng để phân tích trong hóa học hữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên, cho đến gần đây, khả năng bay hơi quá thấp của protein đã làm mất tác dụng của phép ghi phổ khối lượng trong việc nghiên cứu các phân tử này. Khó khăn này đã được khắc phục khi có những kỹ thuật chuyển protein và những đại phân tử khác thành dạng khí được đưa vào ứng dụng là matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) và electrospray spectrometry. Ở đây tập trung vào kỹ thuật MALDI.