Ứng dụng của sinh học phân tử trong y học

LOGO Sinh viên thực hiện: Đỗ Phong Lƣu Nguyễn Thị Hoa Thùy Giáo viên hướng dẫn : Trần Thị Dung LOGO Khái quát chungI Một số bệnh di truyền thƣờng gặpII Một số phƣơng pháp phát hiện các biến dị di truyền ở mức phân tửIII Chẩn đoán bệnh di truyềnIV V Tƣ vấn di truyền NỘI DUNG I. KHÁI QUÁT CHUNG  SHPT là ngành khoa học khảo cứu ở mức độ phân tử cấu trúc của sinh vật, cơ chế hoạt động và điều tiết, sự tác dụng hỗ tƣơng của các phân tử này.  Với những tiến bộ về kỹ thuật trong những năm gần đây, với sự đóng góp đắc lực của các máy tính, SHPT trở thành ngành "mũi nhọn" của sinh học và y học. II. MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƢỜNG GẶP 1. Bệnh Tay-sachs :  Ðây là bệnh di truyền, thƣờng gặp ở ngƣời châu Âu, do thiếu gen mã hóa tổng hợp enzym hexozaminidaza A có tác dụng phân hủy gangliozid GM2.  Do không có enzym phân hủy, Gangliozid GM2 tích lũy và ứ đọng gây ra hiện tƣợng chậm phát triển, rối loạn tâm thần, mù lòa, tai biến ngập máu và tử vong. II. MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƢỜNG GẶP 2 ) Bệnh Huntington : Là một bệnh di truyền của hệ thần kinh trung ƣơng, thƣờng biểu hiện ở tuổi từ 25 đến 55.  Triệu chứng ban đầu, cử động vô thức và rối loạn thăng bằng. Khi bệnh nặng lên, các chức năng sống nhƣ ngôn ngữ và đi lại có thể bị sút giảm. Bệnh Huntington liên quan đến phiên bản đột biến của protein huntingtin - kiểm soát việc sản sinh yếu tố hƣớng thần kinh của não (BDNF) Những bệnh nhân có protein huntingtin đột biến không thể sản sinh đƣợc lƣợng BDNF thích hợp, dẫn đến thoái hóa não. II. MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƢỜNG GẶP 3.Bệnh Thalassemia :  Là bệnh lý thiếu máu di truyền thƣờng gặp nhất tại Việt nam và các quốc gia vùng Đông Nam Á, Địa Trung Hải.  Đây là bệnh lý di truyền do sự thiếu hụt tổng hợp một chuỗi globin trong huyết sắc tố của hồng cầu. Hồng cầu bệnh nhân không bền, bị phá huỷ sớm làm bệnh nhân bị thiếu máu và ứ sắt.  người bệnh bị thiếu máu, da nhợt, màu xanh lục, mu bàn tay nhiễm sắc tố nâu, lách rất to, đôi khi gan to, có hiện tượng rối loạn loãng xương. Hồng cầu bị biến dạng trong bệnh Thalassemia II. MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƢỜNG GẶP 4) Bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm :  Bệnh do đột biến gen trên NST thƣờng (đột biến gen mã hóa chuỗi Hbß): thay thế cặp A-T bằng cặp T-A làm cho bộ ba XTX (axit Glutamic) bị biến đổi thành XAX (Valine) trong gen Hbß, làm biến đổi HbA --> HbS .  HbS ở trạng thái khử ôxi kém hòa tan và kết tủa tạo nên hồng cầu có dạng hình lƣỡi liềm, có thời gian tồn tại ngắn dẫn đến thiếu máu. Hồng cầu hình liềm Cơ chế gây đột biến hồng cầu hình liềm Hồng cầu hình liềm gây nghẽn mạch máu II. MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƢỜNG GẶP 5) Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và Becker (BMD):  Là một rối loạn về di truyền đặc trƣng bởi sự thoái hóa và suy yếu dần dần ở cơ.  Dấu hiệu: cơ bị yếu ngay khi bệnh nhân lên 3 tuổi. Bệnh làm yếu dần các cơ xƣơng hay cơ vân (ở tay, chân, thân ngƣời). Khi bƣớc vào tuổi thiếu niên, cơ tim và hệ hô hấp có thể bị ảnh hƣởng.  Bệnh DMD xảy ra khi 1 gen trên NST X không mã hóa sinh ra protein dystrophin. Còn ngƣời bị bệnh BMD có 1 ít dystrophin nhƣng không đủ hoặc có nhƣng chất lƣợng kém. Cấu tạo của 1 bó cơ Cơ chế gây bệnh loạn dƣỡng cơ Duchenne và Becker II. MỘT SỐ BỆNH DI TRUYỀN THƢỜNG GẶP 6) Hội chứng X không bền :  Đây là bệnh di truyền chậm phát triển tâm thần hay gặp nhất ở ngƣời Capcaz, ngoài ra có cả ở ngƣời Nhật, Trung Quốc, ấn Độ, châu Phi.  Bệnh di truyền liên kết giới tính, liên quan đến vùng không đƣợc phiên dịch 5' của exon 1 của gen FMR-1 (Fragile X Mental Retardation 1). III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 1. Điện di protein (protein electrophoresis) :  Điện di protein đã đƣợc dùng để phát hiện các biến dị amino acid trên hàng trăm loại protein ngƣời.  Điện di protein chỉ cho phép phát hiện chỉ khoảng một phần ba các đột biến xảy ra trên các codon của DNA. Kỹ thuật điện di Protein III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 2. Phát hiện đột biến ở mức DNA : a) Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLPs):  Phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ DNA đựơc thực hiện thông qua vai trò của các enzyme giới hạn (đƣợc sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhằmngăn chặn sự xâm nhập của các DNA lạ bằng cách cắt nhỏ những DNA này).  Các DNA lạ sẽ đƣợc cắt tại những vị trí đặc hiệu trên DNA đƣợc gọi là những vị trí ghi nhận hay vị trí giới hạn  Ví dụ: Ở Escherichia coli có một enzyme giới hạn EcoRI ghi nhận một đoạn DNA có trình tự GAATTC. Hình : Cắt DNA bằng enzyme giới hạn EcoRI  Để quan sát đƣợc các đoạn DNA giới hạn ngƣời ta đã thực hiện kỹ thuật :  Xử lí bằng enzyme giới hạn  Điện di  Tách cấu trúc xoắn kép  Cố định DNA  Xác định đoạn DNA đặc hiệu  RFLPs đã đƣợc dùng để phát hiện bệnh đột biến hồng cầu hình liềm.  RFLPs đƣợc sử dụng làm công cụ trong việc định vị nhiều gene bệnh quan trọng nhƣ gene gây bệnh u xơ thần kinh type I (neuro-fibromatosis type I), bệnh Huntington, bệnh xơ nang (cystic fibrosis) v.v... Kỹ thuật phát hiện tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA giới hạn III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 2. Phát hiện đột biến ở mức DNA : b)Sự đa hình trong số lượng của các đoạn lặp (Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism: VNTR)  Một vùng DNA tiểu vệ tinh có thể lặp 2, 3 lần hoặc lên đến trên 20 lần lặp. Số lƣợng này thay đổi rất lớn từ ngƣời này qua ngƣời khác tạo ra nhiều biến dị di truyền trong quần thể  gọi là số lƣợng dao động của các đoạn lặp nối tiếp (variable number of tandem repeats: VNTRs).  Các VNTR đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật tƣơng tự kỹ thuật dùng để phát hiện các RFLP.  Sự đa hình của các vị trí giới hạn chỉ cho phép phát hiện các biến dị dựa vào sự có mặt hoặc vắng mặt của các vị trí giói hạn (chỉ có 2 allele) thì các VNTR cho phép phát hiện các biến dị thông qua sự khác nhau về số lƣợng của các đoạn lặp giữa hai vị trí giới hạn (có thể có > 2 allele)  Các DNA vi vệ tinh (short tandem repeat-STR-các đoạn lặp ngắn) cũng có những biến dị trong chiều dài do kết quả của sự khác nhau trong số lần lặp.Mỗi đoạn lặp ngắn nhƣ vậy có thể lặp đi lặp lại hàng trăm lần.  Tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (short tandem repeat polymorphism: STRP) khác với các VNTR ở kích thƣớc của đoạn lặp và chúng đƣợc phân lập không phải thông qua các vị trí giới hạn nằm cạnh các đoạn lặp mà thay vào đó là bằng kỹ thuật PCR. III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 2. Phát hiện đột biến ở mức DNA : c) Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR  Kỹ thuật PCR cho phép nhân một đoạn DNA đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng vài ngàn kb hoặc ngắn hơn) một cách nhanh chóng thành hàng triệu bản sao giống hệt nhau tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức DNA.  Quá trình thực hiện PCR đòi hỏi các thành phần sau:  Hai đoạn mồi (primer)  DNA polymerase  Một lƣợng lớn các nucleotìde tự do  DNA từ một cơ thể sinh vật cần nghiên cứu  PCR là một quá trình bao gồm ba bƣớc cơ bản:  Tách cấu trúc kép DNA bằng nhiệt độ cao  Lai với đoạn primer ở nhiệt độ thấp  Kéo dài đoạn primer ở nhiệt độ trung gian. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về trình tự . III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HiỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 2. Phát hiện đột biến ở mức DNA : d) Xác định trình tự của DNA (DNA sequencing)  Cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năng của gene, mức độ tƣơng tự của gene với các gene khác đã biết.  Kỹ thuật xác định trình tự của DNA là phƣơng pháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick Sanger đƣa ra. Kỹ thuật xác định trình tự Nucleotide của DNA bằng cách sử dụng phƣơng pháp dideoxy III) MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN BỆNH DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 2. Phát hiện đột biến ở mức DNA : e) Chip DNA (DNA chip)  Là kỹ thuật mới để phát hiện các đột biến đặc hiệu với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng vi tính.  Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide (gồm các DNA có trình tự bình thƣờng và các DNA có trình tự mang các đột biến gây bệnh đã biết) đóng vai trò của các đoạn dò (probe) đƣợc máy cài lên một phiến kính nhỏ. Mỗi phiến kính nhƣ vậy với diện tích khoảng 1cm2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide khác nhau.  Các oligonucleotide đƣợc đặt trên con chip, sau đó cho tiếp xúc với DNA đƣợc gắn huỳnh quang của một đối tƣợng. Quá trình lai xảy ra nếu có một oligonucleotide có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA của đối tƣợng. Ví trí phát huỳnh quang trên chip sẽ đánh dấu vị trí của đoạn oligonucleotide trên chip Sơ đồ minh họa một chip DNA IV. CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN IV. CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN Di truyền y học đã sử dụng các phƣơng pháp và kĩ thuật hiện đại để chẩn đoán chính xác các tật, bệnh di truyền, nhƣ sử dụng đánh dấu di truyền, các enzim chẩn đoán bệnh, kĩ thuật chọc ối chẩn đoán trƣớc khi sinh, kết hợp với các phân tích hoá sinh nƣớc ối, chuẩn đoán bằng DNA phôi thai trong máu mẹ, PCR, real-time PCR, kỹ thuật cắt đoạn đa dạng (RFLP), phƣơng pháp Southern Blot,… IV. CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN 1. Chẩn đoán trước sinh  Mục tiêu chính: cung cấp cho các gia đình có nguy cơ các thông tin cần thiết để họ có thể lựa chọn trong quá trình mang thai.  Những lợi ích của chẩn đoán trước sinh:  Tái khẳng định cho các gia đình có nguy cơ yên tâm khi kết quả chẩn đoán bình thƣờng.  Cung cấp thông tin về nguy cơ đối với các cặp vợ chồng mà nếu không có những thông tin nhƣ thế họ sẽ không dám mang thai.  Chuẩn bị về mặt tâm lý cho cặp vợ chồng trƣớc việc ra đời một đứa trẻkhuyết tật.  Giúp các nhà chuyên môn lên kế hoạch can thiệp trong cuộc đẻ, quản lý và săn sóc sức khỏe cho trẻ sau khi đã chẩn đoán trẻ mắc bệnh di truyền. 1) Chuẩn đoán trƣớc sinh : Các test trong chuẩn đoán trước sinh : Test sàng lọc :  Độ chính xác không lớn  Giá thành thấp  Dễ thực hiện  Cho phép thực hiện trên một lƣợng lớn cá thể  Một kết quả bất thƣờng của test sàng lọc sẽ chỉ định cho các test chuẩn đoán tiếp theo.  Ví dụ : Theo đánh giá anpha – Fetoprotein (AFP) trong máu mẹ vào tuần thứ 15 của thai kỳ để sàng lọc các trƣờng hợp bất thƣờng ống thần kinh của thai nhi. Test chẩn đoán :  Test chẩn đoán đƣợc sử dụng để chẩn đoán xác định các trƣờng hợp nghi ngờ mang bất thƣờng.  Ví dụ : Thực hiện test chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào nƣớc ối đối với những sản phụ từ 35 tuổi trở lên để phát hiện các trƣờng hợp thai nhi mắc trisomy. IV. CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN  Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh hiện nay Hiện nay có nhiều phƣơng pháp khả thi chẩn đoán sớm nhƣ: siêu âm, test sàng lọc bộ ba (triple test)... Phƣơng pháp can thiệp nhƣ: chọc hút nƣớc ối, nuôi cấy tế bào nƣớc ối Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu sinh, y, dƣợc học (Học viện Quân y) vừa nghiên cứu thành công phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh từ tuần thứ 7 của thai kỳ bằng ADN phôi thai trong máu mẹ. Một số bệnh đã đƣợc chẩn đoán trƣớc sinh :  Hội chứng Down: Đƣợc thực hiện từ cuối năm 1999 Kỹ thuật sử dụng là định lƣợng real-time PCR. Kết quả này đã mở ra việc chẩn đoán trƣớc sinh bệnh Down. Sự phát hiện ra ADN phôi lƣu hành trong máu mẹ còn hứa hẹn đƣợc áp dụng trong chẩn đoán trƣớc sinh một số bệnh di truyền khác. Từ tuần thai thứ 7 đã có ADN phôi trong máu của ngƣời mẹ. IV. CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN  Bệnh Duchene: Sử dụng kỹ thuật multiplex PCR với 14 bộ primer để phân tích ADN trong bệnh này. Nghiên cứu cho thấy 63% có khuyết đoạn gen. Hai điểm bệnh lý là ở exon 8-9 và exon 44-51. Kỹ thuật cắt đoạn đa dạng (RFLP) đƣợc sử dụng để phát hiện ngƣời mang gen bệnh và chẩn đoán trƣớc sinh. IV. CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN  RhD của phôi thai: Sử dụng kỹ thuật PCR huỳnh quang để phát hiện gen RhD chỉ trên một tế bào lấy từ ADN máu mẹ. Phát hiện này rất quan trọng để điều trị trƣớc sinh những thai phụ nhạy cảm với RhD khi đối tác là dị hợp tử gen RhD. Bố mẹ có thể yên tâm là thai không có nguy cơ nếu nó RhD (-). Nếu phôi RhD (+) thì tiến hành điều trị. Bệnh phenylceton niệu (PKU): Là bệnh di truyền thiếu enzym phenylalanin hydroxylase (PAH), do có biến dị ở 4 exon 7, 10, 11, 12 của gen điều khiển việc sản xuất PAH. Kỹ thuật chẩn đoán trƣớc sinh bao gồm PCR-SSCP kết hợp với nhuộm bạc để phát hiện các biến dị ở gen này. Hội chứng X không bền: Nǎm 1991, các nhà khoa học đã xác định đƣợc locus X không bền, từ đó phát triển kỹ thuật chẩn đoán ADN. Bây giờ, đã chẩn đoán trƣớc sinh và cho cả những bà mẹ mang gen, sử dụng các kỹ thuật lai tạo Phƣơng Nam (Southern hybridization) và PCR để phát hiện đột biến của X không đều. Chẩn đoán trước sinh một số bệnh di truyền, chuyển hóa khác : Buys (Hà Lan) mới công bố công trình nghiên cứu phát hiện trƣớc sinh và ngƣời mang gen bệnh ứ đọng glycogen týp 1a (bệnh Von Gierke) do thiếu enzym glucose-6-phosphatase. Cao và cộng sự (ý) đã rất thành công trong việc chẩn đoán trƣớc sinh ngƣời mang gen di truyền dị hợp tử bệnh b -thalassemia ở đảo Síp và Sardinia bằng kỹ thuật phân tử, khiến cho tỉ lệ sinh trẻ em mắc bệnh b -thalassemia đồng hợp tử hạ xuống gần bằng 0. Các nhà khoa học Anh, Mỹ đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện đột biến D F508 trong bệnh xơ nang, với độ đặc hiệu 100%. 2. Chẩn đoán phân tử sơ sinh Có một số bệnh di truyền đƣợc chẩn đoán bằng kỹ thuật phân tử ngay từ khi đứa trẻ mới ra đời: _ Các công trình nghiên cứu ở Anh, ý, Tây Ban Nha đã nêu lên giá trị của kỹ thuật ADN phát hiện bệnh tǎng sản thƣợng thận bẩm sinh do thiếu enzym 21-hydroxylase ở trẻ sơ sinh. Kỹ thuật đƣợc sử dụng là Nested PCR đã phát hiện thấy đột biến mất 8bp EX3 của gen hoạt động CYP 21B. Nested PCR Reaction Diagram V. TƢ VẤN DI TRUYỀN 1 ) Mục đích của công tác tƣ vấn di truyền  Cung cấp những thông tin trong lĩnh vực y học bao gồm chẩn đoán, diễn biến của bệnh, các phƣơng tiện hỗ trợ và điều trị hiện có.  Cung cấp những thông tin về khả năng di truyền của bệnh, nguy cơ tái phát  Giúp lựa chọn những biện pháp thích hợp với nguy cơ của bệnh, mục đích của gia đình bệnh nhân, phù hợp với các tiêu chuẩn về đạo đức, tôn giáo của gia đình.  Thực hiện những biện pháp can thiệp tốt nhất trong khả năng cho phép đối với ngƣời bệnh 2 ) Các chỉ định cho công tác tƣ vấn di truyền :  Trƣớc đây gia đình đã có một trẻ với nhiều dị tật bẩm sinh, chậm phát triển trí tuệ hoặc một dị tật chính  Có tiền sử gia đình đối với một bệnh di truyền  Chẩn đoán trƣớc sinh trong trƣờng hợp mẹ lớn tuổi hoặc những chỉ định khác.  Tình trạng hôn nhân đồng huyết.  Vô sinh hoặc sẩy thai liên tiếp.  Một bệnh lý di truyền hoặc bất thƣờng mới đƣợc chuẩn đoán. 3 ) Ngăn ngừa sự tái phát trong gia đình : Tƣ vấn di truyền đƣợc thực hiện cả trƣớc và sau các xét nghiệm trên để giúp định hƣớng trong việc thực hiện các xét nghiệm di truyền và phiên giải các kết quả xét nghiệm đó. Nếu các bố mẹ có kế hoạch không có thêm con hoặc không có con, việc ngừa thai và triệt sản là những biện pháp đƣợc lựa chọn Nếu bố mẹ quyết định chấm dứt thai kỳ họ cần đƣợc tƣ vấn đầy đủ và theo dõi sau khi thực hiện quyết định này. TÀI LIỆU KHAM KHẢO Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long. Chú giải Di Truyền học. Nxb Giáo Dục. 2007 Đỗ Lê Thăng. Giáo trình Di truyền học. Nxb Giáo Dục. 2006 Benjamin A.Pierce, Genetics A Conceptual Approach, 2005 D. Clark, Molecular Biology (Elsevier, 2005) Giáo trình di truyền y học – Trƣờng Đại Học Y Huế Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng – NXB Giáo Dục – 2003.      