Vector chuyển gen là cosmid

Vector chuyển gen là cosmid Các cosmid là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sự đóng gói DNA tái tổ hợp vào đầu của phage. Khi bao gói các vùng cos đều bị cắt, chỉ còn một phần DNA của cosmid được giới hạn bởi các đầu dính với đoạn cài DNA lạ được bao gói. Trong phản ứng bao gói in vitro, các protein cần thiết cho sự tạo thành đầu và đuôi phải được thêm vào để cho các phage có thể tự hợp thành. Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thể cài lắp DNA lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kích thước cosmid ≈ 5kb do đó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb và có thể tới 47kb (như chúng ta đã thấy ở Mục 5.5.2.2, đầu của phage λ có thể bao gói được 52kb). Vào thời điểm gây nhiễm E. Coli, DNA tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắt cặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kín dạng vòng và tái bản như một plasmid. Ưu điểm và ứng dụng của cosmid: Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn. Cấu tạo cosmid Trong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát. Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịu với môi trường có ampiciline. Các vector chuyển gen là phage Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là plasmid: - Dễ xâm nhập vào vi khuẩn, - Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ, - Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid. Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như: - Thao tác ghép DNA lạ phức tạp - DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc thế hệ thứ nhất. 1. Phage λ (thế hệ đầu) Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏ protein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cố định trên các tế bào chủ là vi khuẩn: - DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen. Đầu tận cùng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chúng được gọi là những đầu dính. - Cũng như tất cả virus, DNA này được bao bọc trong vỏ protein. Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách: - Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới được tạo ra sẽ đi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này. - Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với DNA của vi khuẩn. 2. Các biến hình của phage λ (phage thế hệ sau) Các phage thuộc thế hệ thứ hai rất đa dạng, mỗi một loại thích ứng với một mục đích sử dụng. Giảm một số vùng hạn chế giống nhau: Phage λ tự nhiên (chưa biến hình) gọi là phage hoang dại có chứa nhiều vùng hạn chế giống nhau như: - 5 vùng EcoRI - Nhiều vùng Hind III Không thể cắt vector này bằng EcoRI hoặc HindIII đề cài vào đây một mảnh DNA lạ. Người ta đã biến hình loại phage λ này chỉ còn chứa một vùng nhận biết của EcoRI tạo ra vector cài và hai vùng EcoRI tạo ra vector thay thế. Ví dụ: - λ NM607 là vector cài chứa đoạn cài DNA dài 9kb ở vị trí cắt bởi EcoRI trong gen CI. - λ charon 16: DNA được cài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen lacZ. - λ EMBL4 là một vector thay thế, đoạn DNA thay thế dài 23kb. Làm khuyết những phần không cần thiết: Phage λ chỉ có thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế. Khả năng của nó sẽ bị giảm rất nhiều khi độ dài genon (bộ gen) lớn hơn 105% (51 ÷ 52kb) hoặc nhỏ hơn 78% (38 ÷ 38,5kb) so với độ dài ban đầu. Người ta tìm cách tăng chiều dài của đoạn được cài bằng cách giảm đi nhiều hoặc ít chiều dài những phần không cần thiết của genon của phage λ. Trong số các vector bỏ 1/3 phần trung tâm giữa gen J và N. Trong khi đó giữ lại đầu 5’ (tay trái) vốn mã hoá cho protein đầu, đuôi. Cũng như đầu 3’ (tay phải) vốn mã hoá cho protein thiết yếu cho sự tái bản và chu kỳ tan. Phage λ biến hình Phần trung tâm giữa gen J và N không cần thiết cho sự sinh sản của phage có thể được thay bằng DNA lạ. Các đầu mảnh 5’ và 3’ đều là đầu dính. Cài một mảnh của operon lacZ:A Mục đích là chọn ra phage tái tổ hợp mà đem lại khả năng phân biệt bằng mắt các phage λ đã được sát nhập một đoạn cài vào trong bộ gen của chúng. Cơ chế phản ứng thủy phân X-Gal bởi enzyme β-galactosidase Bắt đầu từ phage λ người ta đã cấu tạo nên (biến hình) phage λgt11 đó là một vector biểu hiện. Phage này có cài vào gen lacZ một DNA cần tạo dòng. Các phage gtλ11 tạo ra được các vùng tan trắng nếu chúng đã được cài DNA lạ vào gen lacZ (gen chịu trách nhiệm tổng hợp β-galactosidase). Các phage gtλ11 tạo ra vùng tan xanh nếu như chúng không tiếp nhận đoạn cài DNA lạ. Để phát hiện các phage λ tái tổ hợp, người ta cho vào môi trường chứa phage λ tái tổ hợp (môi trường nuôi cấy) một đường X-Gal (5brome-4chloro- indolyl-β-galactopyroside). Giống như đường lactose, nó bị thuỷ phân bởi enzyme β-galactosidase. Người ta có thể dễ dàng phát hiện khi có mặt của enzyme β-galactosidase.