Các phương pháp sắc ký cột

TS: Ngô Đại Nghiệp  Lớp: SHO7B1 Nhóm 4 MSSV Nguyễn Đinh Diễm Thụy 30700514 Huỳnh Thị Lệ Phương 30760857 Nguyễn Anh Tôn 30700536 Trần Quốc Nhẫn 30700342 Đỗ Minh Trí 30760942 Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Để tinh sạch protein, người ta thường dựa vào các đặc điểm tương đồng và các tính chất khác nhau vốn có của nó. Trong một số trường hợp, để dễ dàng hơn cho việc tinh sạch, người ta gắn vào protein một đuôi acid amin (tag) - tạo ra dạng protein dung hợp (fusion protein). Tủa protein Thẩm tích Siêu lọc Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc lý ái lực miễn dịch, Sắc ký ái lực, Sắc ký trao đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…) Điện di protein (điện đi trên gel Agarose, điện di trên gel Polyacrylamide, điện di protein theo điểm đẳng điện… ) Phương pháp tốt nhất để phân đoạn protein là sắc ký cột (column chromatography). Sắc ký (Chromatography) là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố gen) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh chế các chất. Thông thường, người ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên cứu vào một dung môi (pha động) với lượng vừa đủ, rồi nạp lên cột   theo cách phù hợp sao cho chất nghiên cứu lan thành một lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký. Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. K=Cs/Cm=Nồng độ của hợp chất trong pha tĩnh/Nồng độ của hợp chất trong pha động.   Dụng cụ: Cột sắc kí ( giống như cái buret), gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần vạch chia độ, kích thước lớn hoặc nhỏ tùy yêu cầu sử dụng Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel,) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí. Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột. Thực hiện: Bước 1 là nhồi cột: Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó. Bước 2 nạp mẫu chất vào: Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Bước 3: sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, Bước 4 mở khóa: lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra, mỗi lần hứng khoảng 1/5 hũ .Sau đó đem chấm bản các hủ bi, những hủ có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn. Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất). Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột. Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B. Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần. V. PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:  Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh là chất rắn : thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây carbon dài được gắn lên trên chất mang rắn. Pha động : có thể là chất lỏng hoặc chất khí. Pha động là chất khí: thí dụ trong kỹ thật sắc ký khí. Trong trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vecto. Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột. Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly (eluant). Sắc ký phân chia (Partition chromatography) Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí). Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lòng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn và có tính trơ. Sắc ký hấp thu (Adsorption chromatography) Pha động là chất lỏng hoặc chất khí Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin. Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) Pha động chỉ có thể là chất lỏng. Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. Sắc ký lọc gel ( Size exclusion chromatography; gel filtration chromatography) Pha động chỉ có thể là chất lỏng. Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng. Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kế cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở. Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch. Sắc ký ái lực (affinity chromatography): Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh. Sắc ký lỏng cao áp: Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper and thin- layer chromatography): Trong sắc ký giấy: Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulose Pha động : là chất lỏng. Trong sắc ký lớp mỏng: Chất hấp thu thông dụng torng sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực. Pha động: luôn luôn là chất lỏng Trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, kiểu triển khai sắc ký thông dụng nhất là pha động di chuyển từ dưới thấp lên trên cao. Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa. Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột. Thời gian lưu (retention time): (tR) Với máy sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha tĩnh là bột rắn, nhuyễn cực mịn, được nén trong một ống hình trụ nên cần phải có một thiết bị tạo lực đẩy để giúp pha động di chuyển ngang qua pha tĩnh Thiết bị cảm biến thường được gọi là đầu dò (detector) tạo ra các tín hiệu điện tử để ghi thành sắc ký đồ (chromatography). t’R = tR –tM t’R là thời gian lưu có hiệu chỉnh (adjusted retention time) tM là thời gian của hợp chất không bị cột giữ lại Độ phân giải(Resolution ,R) Từ sắc ký đồ, người ta biết được độ phân giải, ký hiệu R. Độ phân giải của cột sắc ký cho biết cột có khả năng tách các chất riêng ra hay không, được định nghĩa là sự khác nhau về thời gian lưu của hai pic kề sát nhau chia cho giá trị trung bình bề rộng đáy của 2 pic đó VI. CÁC LOẠI PHA TĨNH SỬ DỤNG TRONG SẮC KÝ: Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silica natri (cho tác dụng với acid sulfiric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt… như yêu cầu. Có thể hiệu chỉnh tính hấp thu của silica gel bằng các cho silica gel kết hợp với những hợp chất khác như các bazo, các dung dịch đệm ở mức pH xác định. Cũng có thể thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhất là các alcen. a. Silica gel pha thường: Silica gel- tạo nối dùng cho pha đảo Loại silica gel pha đảo có tính kém phân cực nên có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực, giữ chặt các hợp chất này lại trong cột. Pha động thường là nước Silica gel- tạo nối dùng cho pha thường Thực hiện các phản ứng điều chế tương tự như trên nhưng nhóm chất cuối dãy thường là phenyl, cyano, amino, diol,… Silica gel – tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa lập thể của chúng. Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khí đối phân còn lại không có dược tính đó, mà còn gây độc, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng. b. Silica gel chế hóa: Alumina là oxid aluminium Al2O3 được điều chế với là hydroxid aluminium, có thể điều chỉnh độ pH của dung dịch phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính kiềm hay trung tính. Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong quá trình điều chế là đặc điểm khác nhau giữa alumina và silica gel. Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng ở 400- 500oC trong 12- 16 giờ. Muốn làm giảm hoạt tính, thêm nước vào. Với sắc ký giấy, rất thuận tiện khi sử dụng tờ giấy lọc làm pha tĩnh, nhưng việc sử dụng trực tiếp có nhiều nhược điểm. Ngược lại, nếu pha tĩnh làm bằng bột giấy, các hạt nhuyễn mịn và cùng kích thước sẽ tạo nên pha tĩnh đồng nhất nên pha động di chuyển dễ dàng hơn và chất tan không lan rộng trên bề mặt của pha tĩnh. Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bôt, agar (polysaccarid) hoặc polyacrylamid, trong đó các chuỗi dây dài được nối mạng ngang để tạo thành mạng không gian ba chiều. Gel thường được sử dụng trong sắc ký cột hoặc điện di  Sắc ký cột khô (Dry – column chromatography) Sắc ký nhanh ( còn gọi là sắc ký chớp nhoáng) (Flash chromatography) Sắc ký nhanh- cột khô (Dry – column flash chromatography; Vacuum liquid chromatography) Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi của sắc ký chớp nhoáng, với một vài khác biệt sau: Để gia tăng vận tốc giải ly của pha động, sắc ký chớp nhoáng sử dụng một lực đẩy từ trên đầu cột xuống, còn sắc ký nhanh – cột khô dùng một lực hút tạo chân không ở đầu ra của cột nhờ một máy bơm hút loại nhẹ. Sắc ký chớp nhoáng sử dụng pha tĩnh là silica gel loại dùng cho sắc ký cột, còn sắc ký nhanh- cột khô sử dụng silica gel dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, cỡ hạt 15- 40 micromet. Trong quá trình giải ly, sắc ký chớp nhoáng vẫn giữ một lớp dung môi ở trên đầu cột (cột không được khô), còn với sắc lý nhanh- cột khô cột sắc ký được rút khô san mỗi phân đoạn thu được. [1] Nguyễn Kim Phi Phụng; Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ; nhà xuất bản ĐHQG Tp.HCM – 2007 . [2] A. Braithwaite, F.J.Smith. Chromatographic methods. Kluwer Academic Publishrs. Boston- london, 45-501,1999. [3] W.Clark Still, Michael Kahn Abhijit Mitra. Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution. J. Org. chem, 1978