Chủ đề: Nuôi cấy mô – tế bào thực vật bằng tế bào trần và kĩ thuật chuyển gen

Chủ đề: NUÔI C Y MÔ – T BÀO Ấ Ế TH C V T B NG T BÀO Ự Ậ Ằ Ế TR N VÀ KĨ THU T Ầ Ậ CHUY N GENỂ KHÁI NI MỆ Nuôi cấy mô­ tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép  nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô  phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo  thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những  cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. C S SINH LÍ C A CÔNG NGH Ơ Ở Ủ Ệ NUÔI C Y MÔ- T BÀOẤ Ế  TÍNH TOÀN NĂNG:   Là khả năng của 1 tế bào  hình thành 1 cây hòa  chỉnh trong điều kiện nuôi  cấy thích hợp, do trong tế  bào có chứa bộ  AND(NST) hoàn chỉnh,  chứa toàn bộ thông tin di  truyền cho 1 chu kì sống  hoàn chỉnh.         AND       mARN       Protêin       tính trạng  Tùy t ng t bào, t ng ừ ế ừ lo i mô, t ng th i kì sinh ạ ừ ờ tr ng, phát tri n mà ưở ể các gen phù h p ho t ợ ạ đ ng; các gen không ộ cùng ho t đ ng nh ạ ộ ư nhau trong các giai đo n ạ phát tri n c a c th (do ể ủ ơ ể c ch đi u hòa ho t ơ ế ề ạ đ ng c a gen).ộ ủ  S PHÂN CHIA, PHÂN HÓA, PH N PHÂN HÓA C A Ự Ả Ủ T BÀO:Ế  Phân hóa: 1 t bào 1kh i t bào(phân hóa) mô c quan ế ố ế ơ h c quan.ệ ơ  Ph n phân hóaả : khi các t bào đã phân hóa thành các ế mô ch c năng riêng bi t nh ng v n có th quay v ứ ệ ư ẫ ể ề tr ng thái ch c năng phôi sinh ban đ u ki g p đi u ạ ứ ầ ặ ề ki n thu n l i.ệ ậ ợ • Các đ c tính trên ặ đ c xác đ nh d a ượ ị ự trên c s là đ c đi m ơ ở ặ ể di truy n nh ng s ề ư ự thay đ i môi tr ng ổ ườ cũng có nh h ng ả ưở tr c ti p đ n các đ c ự ế ế ặ tính đó. CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BỎ THÀNH  CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI  CẤY MÔ­ TẾ BÀO THỰC VẬT:  Đảm  bảo điều kiện  vô trùng, phòng thí  nghiệm phải chuyên  hóa cao.  Chọn đúng môi  trường và chuẩn bị  môi trường đúng  cách.  Chọn mô cấy, xử lí  mô cấy thích hợp  trước và sau khi cấy. CÁC B C TRONG KĨ TH Y NUÔI ƯỚ Ậ C Y MÔ- T BÀO TH C V TẤ Ế Ự Ậ  T o v t li u kh i đ uạ ậ ệ ở ầ : th ng ch n ch i là ườ ọ ồ b ph n nuôi c y thích h p nh t kh ộ ậ ấ ợ ấ ử trùng c y trong môi tr ng kh i đ ng đ ấ ườ ở ộ ể tái sinh  Giai đo n nhân nhanhạ : v t li u ậ ệ kh i đ u ở ầ đ c chuy n sang môi tr ng nhân nhanh có b ượ ể ườ ổ sung Xitokinin đ tái sinh 1 thành nhi u ch i.ể ề ồ  Giai đo n t o cây hoàn ch nhạ ạ ỉ : tách riêng các ch i cho vào môi tr ng t o r (b sung ồ ườ ạ ể ố Auxin) m i ch i ra r thành 1 cây hoàn ch nh.ỗ ồ ể ỉ  Giai đo n ra câyạ : cây trong ng nghi m đ ố ệ ủ tiêu chu n (chi u cao, s lá, s r ) s đ c ẩ ề ố ố ể ẽ ượ chuy n sang môi tr ng t nhiên.ể ườ ự CÁC HÌNH THỨC NUÔI  CẤY MÔ • Nuôi cấy mô thực vật • Nuôi cấy mô bằng tế bào  trần NUÔI C Y MÔ TH C V TẤ Ự Ậ  Nuôi c y mô c a c ấ ủ ơ quan tách r i:ờ VD: c cà r t c t látủ ố ắ tách m nh m ch rây x ả ạ ử lí+ nuôi c y mô phôi ấ phôi n y m m cây non ả ầ trong ng nghi m cây ố ệ tr ng thànhưở  Nuôi cấy từ mô hay cơ  quan:   VD: từ 1 mô lá   tách tế  bào   nuôi cấy trên  đĩa Pêtri    điều kiện  thuận lợi sẽ hình  thành những cây non    trồng chậu    phát  triển cây trưởng  thành.  Nuôi c y đ nhấ ỉ sinh tr ng:ưở T 1 mô phân sinh c a ừ ủ đ nh sinh tr ng c a ỉ ưở ủ r ho c thân nuôi c y ễ ặ ấ trong môi tr ng dinh ườ d ng s t o nên cây ưỡ ẽ ạ con Nuôi c y mô s o t h t ấ ẹ ừ ạ ph n( Auxin r t quan ấ ấ tr ng): ọ Nuôi c y bao ph n có h t ấ ấ ạ ph n chín môi tr ng ấ ườ thu n l i bao ph n chín ậ ợ ấ s phân hóa b ng cách: ẽ ằ nhân sinh s n s tiêu ả ẽ bi n nhân sinh d ng ế ưỡ s nguyên phân t o mô ẽ ạ s o ẹ nuôi d ng cây ưỡ đ n b i(n) x lí ơ ộ ử cônxixin cây tr ng ưở thành(đ n b i kép). ơ ộ NUÔI C Y MÔ B NG T BÀO Ấ Ằ Ế TR NẦ  Khái ni m t bào tr nệ ế ầ : Là t bào th c v t b ế ự ậ ị lo i b vách b i 1 x ạ ỏ ở ử lí enzim. Đó là t bào ế t do, cô l p, không ự ậ đ nh h ng( vì không ị ướ còn ch u s t ng ị ự ươ quan trong h th ng ệ ố th c v t). ự ậ S CÔ L P VÀ NUÔI C Y T BÀO Ự Ậ Ấ Ế TR NẦ  S cô l pự ậ : Tr c h t ph i x lí v t ướ ế ả ử ậ li u ệ kh iở đ u( lá, mô ầ s o, d ch treo t bào…) ẹ ị ế v i enzim phân h y ớ ủ vách( Xenlulaza, HemiXenlulaza, Pectolyaza…). Ví dụ: phương pháp tạo  tế bào trần từ lá: Lá  làm sạch lá bằng  Clorox 10%      rửa lại  lá 3 lần bằng nước cất  tiệt trùng     tách lớp  biểu bì dưới của lá+  gây co nguyên sinh  1h bằng Mannitol  10%   enzim  thu được  tế bào trần. S c tr ng t bào bình ứ ươ ế th ng thì đ c cân ườ ượ b ng v i s c ép c ằ ớ ứ ơ h c c a vách vách ọ ủ m t, đ t bào không ấ ể ế b v thì cho vào nh ng ị ỡ ữ ch t gây co nguyên ấ sinh (CaCl2,KCl,Mannitol…) hòa tan trong Enzim khi x líử S NUÔI C YỰ Ấ Thành ph n c a môi ầ ủ tr ng nuôi c y l ng ườ ấ ỏ hay đ c tùy thu c vào ặ ộ vaät li u th c ệ ự v t.Môi tr ng này có ậ ườ thêm Auxin và Xitokinin đ giúp s ể ự tái t o vách và các l n ạ ầ phân cia đ u tiênầ  Đ m b o đ các y u ả ả ủ ế t dinh d ng: axit ố ưỡ amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, n c d a, m ch nha…ướ ừ ạ  Đ m b o đi u ki n ả ả ề ệ nhi t đ , PH, ánh ệ ộ sáng,áp suát th m ẩ th u….ấ • Trong l n t nhân đôi ầ ự đ u tiên, môi tr ng ầ ườ ph i có áp su t th m ả ấ ẩ th u cao, Auxin, ấ Xitikinin thích h p, ợ ánh sáng y u.ế • Sau đó c n gi m áp ầ ả su t th m th u b ng ấ ẩ ấ ắ cách pha loãng môi tr ng đ giúp cho s ườ ể ự tăng tr ng t bào.ưở ế  Khi mô s o đ c hình ẹ ượ thành c n chuy n ầ ể chúng vào trong môi tr ng r n ch a Auxin ườ ắ ứ n ng đ th p h n ở ồ ộ ấ ơ và Xitokinin cao h n.ơ  Sau cùng kích thích ra r c n lo i Xitokinin, ễ ầ ạ tăng n ng đ Auxin.ồ ộ • Thông thường, tế  bào trần cần 1­2  ngày cho sự hình  thành vách, 2­7  ngày cho các lần  nhân đôi đầu tiên,  3­4 tuần cho sự  tăng trưởng mô  sẹo, sau đó 1­2  tháng để có phôi  hình cầu, 1tháng  nữa để có cây nảy  mầm. ÍCH LỢI CỦA TẾ BÀO TRẦN • Tế bào trần có khả năng tái  tạo vách và cho phôi thể hệ. • Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra  1 mô hình hấp dẫn để theo  dõi quá trình sinh phôi thể hệ  từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt  biết được sự sắp xếp các sợi  Xenluloz để xác định hướng  kéo dài tế bào, vị trí và hướng  của mặt phẳng phân chia. • Thu n l i cho s ậ ợ ự nghiên c u v sinh ứ ề lí t bào: tính th m ế ấ c a màng, v n ủ ậ chuy n các ch t ể ấ hòa tan, ion, c ch ơ ế ho t đ ng c a ạ ộ ủ hoocmon th c ự v t…ậ • Tế bào trần có thể chịu các xử lí gây đột biến và được dùng để tạo ra các dòng tế bào có nguồn gốc đơn bào. • Tế bào trần thiết yếu cho sự lai thể hệ( dung hợp tế bào trần) và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…) M R NG NUÔI C Y MÔ Ở Ộ Ấ B NG KĨ THU T DUNG H P Ằ Ậ Ợ T BÀO TR N VÀ KĨ THU T Ế Ầ Ậ CHUY N GENỂ S LAI TH H B NG KĨ Ự Ể Ệ Ằ THU T DUNG H P T BÀO Ậ Ợ Ế TR NẦ • Khái ni mệ : Dung h p là hi n ợ ệ t ng c t đ t màng ượ ắ ứ sinh ch t n i ti p xúc ấ ơ ế gi a 2 t bào tr n ữ ế ầ khác loài do tác đ ng ộ c a các nhân t bên ủ ố ngoài. Sau đó là s tái ự t ch c các màng ban ổ ứ đ u thành 1 và bao ầ l y t bào ch t và 2 ấ ế ấ nhân cha m .ẹ CÁC HÌNH THỨC DUNG HỢP • Tự dung hợp:  Vì màng sinh chất của  tế bào(­) do nhóm P  và Protein nên các  tế bào trần đẩy nhau  nên không tự dung  hợp. Do đó phải làm  các rế bào trần tiếp  xúc nhau nhờ PEG  hay sốc điện.   Hóa dung hợp:   Sự hóa dung hợp có thể thực hiện  với NaNO3 0,25M, PVA 15 %… nhưng tần số dung hợp thấp nên ít  được sử dụng.    Virut Senday đã giảm hoạt tính là  chất thường dùng hiện nay bằng  cách cho giọt hỗn hợp 2 loại tế  bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt  PEG 25­ 50% • i n dung h p Đ ệ ợ (tốtnhất): Khi đặt hỗn hợp 2 loại tế bào trần trong 1 điện trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc nhau và xếp thành 1 chuỗi dài dưới lực điện trường Sau đó dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt ở màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc. NH NG BI N Đ I C A T BÀOỮ Ế Ổ Ủ Ế • Ph n l n t bào lai có b NST không b n, nh t là ầ ớ ế ộ ề ấ t cha m xa nhau, 1 vài NST b h y b sau 1 vài ừ ẹ ị ủ ỏ l n phân bào. Tính b n ch th y đ c sau nhi u ầ ề ỉ ấ ượ ề l n nhân đôi.ầ • Dung h p t bào tr n có th theo 2 ki u:ợ ế ầ ể ể  Dung h p nhân 1 ph n hay toàn ph n: hình thành t ợ ầ ầ ế bào lai.  1 trong 2 nhân cha m đ c gi : t bào ch t laiẹ ượ ữ ế ấ C 2 đ u mang gen trong t bào ch t.ả ề ế ấ ÍCH L I VÀ TR NG I C A Ợ Ở Ạ Ủ NUÔI C Y T BÀO TR NẤ Ế Ầ • Ích l iợ : giúp lo i tr tính b t th h u tính, t o ạ ừ ấ ụ ử ạ cây lai h u th ; Giúp chuy n nh ng đ c tính có ữ ụ ể ữ ặ l i vào cây trợ ngồ , ít đòi h i ph ng ti n ph c ỏ ươ ệ ứ t p; Không c n hi u bi t chính xác v s liên h ạ ầ ể ế ề ự ệ gi a các gen, ít t n kém, nhanh và tr c ti p.ữ ố ự ế • Tr ng iở ạ : Quá trình cô l p nuôi c y ph i hoàn ậ ấ ả thi n.ệ Ch a có ph ng pháp hi u qu đ ư ươ ệ ả ể tuy n ch n các s n ph m phù h p.ể ọ ả ẩ ợ SỰ CHUYỂN GEN  TRONG KĨ THUẬT  NUÔI CẤY MÔ CÁC KHÁI NIỆM VỀ KĨ THUẬT  DI TRUYỀN • Lai phân tử: Là sự dung hợp hai phân tử ADN có nguồn  gốc khác nhau hình thành một phân tử ADN  lai( ADN tái tổ hợp) hoặc hình thành một  phân tử ADN lai gồm hai mạch: một mạch là  chuỗi PolyNu, mạch đối xứng là chuỗi  PolyRinu Coâng ngheä di truyeàn (öùng duïng cuûa kó thuaät di truyeàn) : Laø quy trình söû duïng kó thuaät di truyeàn ñeå saûn xuaát saûn phaåm sinh hoïc treân quy moâ coâng ngieäp ñeå ñaùp öùng nhu caàu cho con ngöôøi. Laø quaù trình coù tính toaùn ñeán saûn phaåm, giaù thaønh, kinh teá. • Kĩ thu t di truy n:ậ ề Là kĩ thu t thao tác trên ậ v t li u di truy n d a ậ ệ ề ự trên nh ng hi u bi t v ữ ể ế ề c u trúc c a AxitNucleic ấ ủ và di truy n vi sinh v tề ậ . Sự truyền Gen: Là sự biến đổi bộ gen tế bào bởi sự xen vào đó 1  đoạn ADN ngoại lai sinh. ADN tái tổ hợp: Là phân tử ADN lai đạt được do sự kết hợp giữa 2  trình tự ADN của 2 loài khác nhau, hoặc cũng có  thể được hình thành từ 1 mạch ARN và 1 mạch  AND. • Các Enzym công cụ: Enzym c t(restriction Enzymắ ): có kh năng ả nh n bi t và c t ADNs i kép bh ng v ậ ế ắ ợ ở ữ ị trí r t chính xác.ấ Ligaza: n i li n 2 đo n ADN b ng cách t o ố ề ạ ắ ạ các m i liên k t P dieste liên k t các Nu.ố ế ế Reverse transcrip tase: cho phép sao chép ng c( t c s t ng h p cADN t mARNượ ứ ự ổ ợ ừ . Véct  truy n:ơ ề  Phân t  ADN nh  ử ỏ c dùng   ghép  o n ADN c n đượ để đ ạ ầ nghiên c u g i là véct  truy n.ứ ọ ơ ề                        Th ng dùng ườ là Plasmid vi khu n hay ADN ẩ virut. S t o dòng gen:ự ạ Là quá trình cô l p và ậ thu nh n nhi u b n sao gi ng nhau ậ ề ả ố c a 1 gen hay 1 đo n gen d a trên kh ủ ạ ự ả năng t nhân đôi c a ADN. Đây là c ự ủ ơ s cho s tăng b i đo n ADN c n ở ự ộ ạ ầ nghiên c u.ứ Sự sàng lọc và dò phân tử: Sự sàng lọc  là quá trình tuyển chọn các Vectơ  chứa đoạn ADN cần nghiên cứu. Sự  tuyển chọn thực hiện nhờ lai phân tử  kết hợp với 1 dò phân tử.                                            Dò phân tử:  Là các đoạn axit Nuclêôtit( ADN,  ARN) sợi đơn: 20 đến vài trăm Nu;  Người ta dùng để đánh dấu đoạn axit  Nuclêôtit cần nghiên cứu trong 1 phản  ứng gọi là’’ lai phân tử’’ nhờ được  đánh dấu phóng xạ và có tính bổ  sung và đối song với 1 vùng củ đoạn  A.Nu cần nhận biết. SỰ CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP  BỞI AGROBACTERIUM SỰ CHUYỂN GEN TRỰC  TIẾP(BIẾN NẠP) • Các phương pháp chuyển gen trực tiếp:  hoá thẩm, điện thẩm, súng bắn ADN: Hoá thẩm: dùng PEG và dùng tế bào  trần.(tần số chuyển gen thấp) i n th mĐ ệ ẩ : dùng xung  i n cao áp và t  bào đ ệ ế tr n.ầ  C  s  c   i n th m là khi t  bào ch u s  ơ ở ủ đ ệ ẩ ế ị ự tác  ng c a xung  i n cao áp, các l  nh  độ ủ đ ệ ổ ỏ t m th i  c t o thành trên màng tr  nên ạ ờ đượ ạ ở th m, ADN vào t  bào  c theo khuynh ấ ế đượ h ng n ng  .  Tuy nhiên s  l   c t o ướ ồ độ ố ổ đượ ạ thành t ng theo  i n th  cho t i 1 giá tr  ă đ ệ ế ớ ị t i h n( quá  i m này màng s  b  t n th ng ớ ạ đ ể ẽ ị ổ ươ không hoàn ngh ch).ị Sự thành lập các lỗ nhỏ có thể do: Điện trường làm thay đổi cân bằng điện tích lớp P lipit màng Tính lỏng tạo nên những chổ yếu tạm thời dễ bị đứt dưới ảnh hưởng của điện trường. K  THU T B N ADNĨ Ậ Ắ • Các Plasmid có mang các gen l  ạ c c   inh trên các h t kim đượ ố đ ạ lo i( vàng hay tungsten) có  ng ạ đườ kính 0.000006m nh  l c hút t nh ờ ự ĩ i n. Các h t kim lo i­ Plasmid đ ệ ạ ạ này  c b n v i v n t c l n   đượ ắ ớ ậ ố ớ để xuyên qua vách, màng và xen vào  b  gen nhân t  bào  ích.ộ ế đ     Màng t  bào có 1 tính d o hoàn ế ẻ h o nên d  dàng s a ch a sau khi ả ễ ử ữ b  t n th ng.ị ổ ươ Các phân t ADN tách kh i h t kim lo i sau ử ỏ ạ ạ khi vào nhân t bào gia nh p vào ADN NST ế ậ c a t bào.ủ ế Ưu điểm:   Nhanh, dễ thực hiện, ít công đoạn,  hiệu quả kinh tế cao không chuyên biệt cho  loài                    Không đòi hỏi cô lập và nuôi cấy  tế bào trần.                    Dễ phát hiện các tế bào có mang  gen được chuyển. Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền.                      Tần số chuyển gen thấp. • C ph ng pháp gián ti p và tr c ti pả ươ ế ự ế : sau khi t bào th c v t đã mang gen đ c tính, ế ự ậ ặ chúng s nguyên phân nhi u l n t o ra1 ẽ ề ầ ạ kh i t bào phân hoá t o mô c quan ố ế ạ ơ cây tr ng thành.ưở • Thaønh töïu – öùng duïng cuûa kó thuaät  nuoâi caáy moâ baèng teá baøo traàn vaø  kó thuaät chuyeån gen      Baèng phöông phaùp dung hôïp teá baøo  traàn vaø aùp duïng kó thuaät chuyeån gen  caùc nhaø khoa hoïc ñaõ vöôït qua moïi raøo  caûn sinh hoïc trong töï nhieân ñeå taïo caùc  teá baøo lai vaø caùc gioáng thöïc vaät mang  caùc gen mong muoán. Goùp phaàn quan  troïng trong vieäc caûi tieán gioáng caây  troàng, taêng naêng suaát.        Taêng tính choáng chòu vôùi  caùc ñieàu kieän khí haäu, thoå  nhöôõng baát lôïi       Taêng khaû naêng khaùng thuoác  dieät coû       Taêng khaû naêng choáng chòu  vôùi caùc coân truøng vaø boï caùnh  cöùng (baèng caùch chuyeån gen maõ  hoaù toång hôïp thuoác tröø saâu  trong caây thöïc vaät)  Taêng khaû naêng phoøng tröø beänh caây  Taêng naêng suaát caây troàng  Taïo thöùc aên chöùa khaùng theå ñaëc hieäu cho gia suùc Tuy nhieân cuõng coù moät soá  haïn cheá  AÛnh höôûng söùc khoeû coäng  ñoàng AÛnh höôûng m oâi tröôøng sinh  thaùi  Aûnh höôûng kinh teá chính trò  xaõ hoäi