Phân lập, tuyển chọn chủng nấm nội sinh từ cây đước bộp (Rhizophora mucronata) có khả năng kháng oxy hóa

Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 28 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM NỘI SINH TỪ CÂY ĐƯỚC BỘP (RHIZOPHORA MUCRONATA) CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA Nguyễn Hà Như Mai, Cao Thị Mộng Cẩm, Trần Trúc Quỳnh, Văn Tiến Dũng (Sinh viên năm 3, Khoa Sinh học) GVHD: ThS Trần Thị Minh Định TÓM TẮT Trên cơ sở phân lập, tuyển chọn các chủng nấm nội sinh có hoạt tính kháng oxy hóa trên cây Đước bộp, chúng tôi đã phân lập được 20 chủng nấm nội sinh. Trong đó, 7 chủng thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa và chủng Daldinia eschscholzii có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất. Cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng này thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa ở cả 2 phương pháp bẫy gốc tự do DPPH và xác định hàm lượng MDA. 1. Mở đầu Trong cơ thể con người, tồn tại rất nhiều gốc tự do. Ở nồng độ thấp, chúng đóng vai trò quan trọng trong sự truyền tín hiệu, chống lại virus và vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, ở nồng độ cao các gốc tự do phản ứng với protein, lipid, DNA và gây tổn thương đến một số cơ quan như gan, thận, não, phổi Theo các nhà khoa học, cơ chế gây tổn thương các bộ phận bên trong cơ thể thường bắt đầu từ sự gia tăng quá trình peroxide hóa lipid ở màng tế bào gây ra bởi các gốc oxy hóa tự do như superoxide (O2*), hidroxyl (OH*), hidroperoxide (HOO*), peroxide (ROO*), oxide nitric (NO*), ion peroxidenitrite (NO3*),[3]. Bình thường, cơ thể người có khả năng tạo ra các chất chống oxy hóa nội sinh góp phần ngăn chặn quá trình peroxide hóa lipid ở màng tế bào. Tuy nhiên, khi con người phải chịu nhiều tác động xấu từ môi trường bên ngoài, đặc biệt là điều kiện môi trường ô nhiễm và thực phẩm thiếu an toàn như hiện nay thì chất kháng oxy hóa nội sinh không được tổng hợp kịp thời để bảo vệ cơ thể. Tỉ lệ mắc bệnh về gan ở nước ta ngày càng cao. Vì vậy, việc bổ sung chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên vào cơ thể để bảo vệ gan là vấn đề cần thiết và cấp bách hiện nay. Hiện nay, các hợp chất kháng oxy hóa được khai thác từ nhiều nguồn tài nguyên khác nhau, trong đó nấm nội sinh được biết đến là nguồn sản xuất giàu tiềm năng [8]. Tuy nhiên, ở Việt Nam nói chung và rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ nói riêng có rất ít công trình nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa (HTKOH) của nấm nội sinh. Với những lí do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng nấm nội sinh từ cây Đước bộp (Rhizophora mucronata) có khả năng kháng oxy hóa với hi vọng tìm được những chủng nấm có hoạt tính kháng oxy hóa cao làm tiền đề cho Năm học 2016 - 2017 29 việc sản xuất ra các sản phẩm có tác dụng trong việc phòng ngừa và điều trị một số bệnh về gan. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Các chủng nấm sợi nội sinh phân lập từ cây Đước bộp (R. mucronata) ở RNM Cần Giờ. 2.2. Phương pháp phân lập các chủng nấm nội sinh [7] Các mẫu rễ, thân, lá của cây Đước bộp (R. mucronata) sau khi thu về sẽ được rửa sạch đất, cát và bụi bẩn bám trên mẫu bằng nước cất, sau đó để khô nước tự nhiên. Tiếp tục, các mẫu rễ, thân, lá sau khi khô nước sẽ được khử trùng bề mặt trong điều kiện vô trùng. Dùng dao vô trùng cắt nhỏ các mẫu thân, rễ với kích thước 0,5 – 1 cm và mẫu lá với kích thước 0,5 – 0,5 cm. Sau đó chuyển vào đĩa petri chứa môi trường malt extract agar (MEA) có bổ sung 10.000 đơn vị natri benzyl penicillin và 0,05 g streptomycin sulfat trong 100 ml dung dịch và đem ủ trong vòng 4 - 5 ngày để các chủng nấm phát triển. 2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [2] Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cấy chấm điểm vào mặt thạch ở giữa. Để bào tử nấm phát triển thành khuẩn lạc ở nhiệt độ phòng và hằng ngày lấy ra quan sát và mô tả các đặc điểm: kích thước khuẩn lạc để biết tốc độ phát triển của nó, hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc, sắc tố nấm tạo ra, dạng sợi nấm mọc ở mặt trên môi trường, đặc điểm của mép khuẩn lạc, và giọt tiết (nếu có). 2.4. Phương pháp tạo cao ethyl acetate [7] Sau 7 ngày nuôi trên máy lắc, dịch nuôi và sinh khối được đem chiết xuất với một lượng dung môi ethyl acetate tương đương, sau đó lọc và thu lấy dịch lọc. Phần dịch lọc thu được sẽ cho vào bình lóng, lúc này dịch lọc trong bình lóng sẽ tách thành hai lớp, loại bỏ phần dịch nuôi phía dưới, thu phần ethyl acetate có chứa hoạt chất phía trên. Tiếp tục sử dụng máy cô quay chân không để loại bỏ dung môi ethyl acetate trong kiện nhiệt độ 50oC áp suất 300 mbar ta thu được cao ethyl acetate từ nấm nội sinh. 2.5. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH [7] Nguyên tắc: Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho H+, làm giảm độ hấp thu cực đại tại bước sóng 517 nm. Màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, từ màu tím chuyển thành màu vàng cam. Cường độ màu được xác định bằng cách đo mật độ quang OD ở bước sóng λ = 517 nm. Giá trị đo mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ khả năng bẫy gốc tự do của mẫu thử càng cao.  Thí nghiệm được tiến hành như sau Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 30 - Hòa tan 0,01 g cao ethyl acetate hòa tan vào 10 ml dung dịch ethanol, thu được dung dịch có nồng độ 1000 µg/ml. Sau đó tiến hành pha loãng dung dịch thành các nồng độ từ 100 đến 1000 μg/ml. - Sau khi pha mẫu thử thành các nồng độ khác nhau, lấy 100 µl mẫu thử cho vào mỗi ống nghiệm. - Bổ sung thêm 1,9 ml dung dịch DPPH ở nồng độ 300 µM. - Ủ 30 phút trong điều kiện không có ánh sáng ở nhiệt độ phòng. - Tiến hành đi mật độ quang OD ở bước sóng λ= 517nm. 2.6. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro bằng phương pháp thử nghiệm MDA [1] Nguyên tắc: Xác định khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA. MDA là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid, thường được chọn là chỉ số để đánh giá mức độ tổn thương tế bào do stress oxy hóa. Khi cho MDA phản ứng với acid thiobabituric tạo phức hợp màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện thông qua việc làm giảm màu của phức hợp này do làm giảm hàm lượng MDA trong mẫu. Cường độ màu được xác định bằng cách đo mật độ quang OD ở bước sóng λ = 532 nm. Giá trị đo mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu thử càng cao.  Thí nghiệm được tiến hành như sau - Hòa tan 0,01 g cao ethyl acetate hòa tan vào 10 ml dung dịch methanol, thu được dung dịch có nồng độ 1000 µg/ml. Sau đó tiến hành pha loãng dung dịch thành các nồng độ từ 100 đến 1000 μg/ml. - Tách gan chuột và nghiền trong dung dịch đệm phosphate 50 mM theo tỉ lệ 1 : 10 (gan : dung dịch đệm). - Sau đó lấy 0,5 ml dịch đồng thể thêm vào 0,1 ml các nồng độ thử và thêm 1,4 ml dung dịch đệm phosphate, ủ ở 37oC trong 15 phút. - Kết thúc phản ứng bằng 1ml dung dịch acid tricloacetic. Sau đó li tâm lạnh ở 4oC, trong 10 phút, tốc độ 10000 vòng/phút. - Lấy 2 ml dịch trong phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 15 phút và đo OD ở bước sóng 532 nm. 2.7. Phương pháp xử lí số liệu Số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft Office Ecxel 2010 và phần mềm Statgraphics plus 3.0. 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm nội sinh từ cây Đước bộp R. mucronata Sau khi phân lập các chủng nấm nội sinh từ các các bộ phận khác nhau (rễ, thân, lá) trên cây Đước bộp R. mucronata từ RNM Cần Giờ. Dựa vào quan sát những đặc Năm học 2016 - 2017 31 điểm hình thái của khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, mép khuẩn lạc, cách mọc trên môi trường nuôi cấy. Chúng tôi đã thu được 20 kiểu khuẩn lạc khác nhau (kí hiệu từ R1-R7, T1-T12, L1). Kết quả thể hiện qua bảng 3.1. Bảng 1. Đặc điểm hình thái đại thể của các chủng nấm sợi nội sinh phân lập từ cây Đước bộp STT Kí hiệu chủng Đặc điểm hình thái của các chủng nấm 1 R1 Khuẩn lạc mọc chậm, màu trắng, mép không đều. Mặt dưới màu vàng cam. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 2 R2 Khuẩn lạc mọc nhanh, màu xám, mép đều. Mặt dưới khuẩn lạc có màu đen. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 3 R3 Khuẩn lạc màu trắng, tròn, khuẩn ti khí sinh phát triển mạnh, mọc dày ở phía ngoài. Mặt dưới có màu xanh đen. Hệ sợi nấm phát triển nhanh trên môi trường và không tiết sắc tố. 4 R4 Khuẩn lạc tròn, màu trắng, sợi nấm dài mảnh, mọc gần hết đĩa, mọc dày ở phía ngoài. Mặt dưới có màu xanh rêu sậm, ở giữa màu vàng đen. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 5 R5 Khuẩn lạc màu trắng, mịn, mép gần tròn, sợi nấm ngắn, ở giữa mọc dày hơn và nổi lên. Mặt dưới hơi vàng. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 6 R6 Khuẩn lạc màu trắng, hơi lớn, sợi nấm mịn, ở giữa mọc ít tạo thành lỗ. Gần mép sợi nấm mọc dày lên tạo thành vòng. Mặt dưới hơi vàng, có các tia ngắn. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 7 R7 Khuẩn lạc màu trắng, mọc dày, mép không đều. Mặt dưới hơi vàng. Nấm không tiết sắc tố và giọt tiết. 8 T1 Khuẩn lạc màu trắng đục, sợi ngắn, mép không đều. Ở giữa sợi nấm mọc dày lên tạo thành vòng. Mặt dưới có màu rêu hơi vàng. Hệ sợi nấm phát triển chậm trên môi trường và không tiết sắc tố. 9 T2 Khuẩn lạc màu trắng ngà, mép gần đều, sợi nấm ngắn, ở giữa mọc hơi thưa và có màu sậm hơn. Mặt dưới có màu nâu rêu. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 10 T3 Khuẩn lạc màu trắng sữa, mép không đều, mép nổi dày lên có hình dạng bông hoa. Mặt dưới có màu rêu vàng ở giữa. Hệ sợi nấm phát triển chậm trên môi trường và không tiết sắc tố. 11 T4 Khuẩn lạc lớn, màu trắng đục, sợi dày, ở giữa dày hơn và sậm màu hơn. Mặt dưới hình thành các vòng màu vàng đậm. Hệ sợi nấm phát triển nhanh trên môi trường và không tiết sắc tố. 12 T5 Khuẩn lạc màu trắng hơi ngà, ở giữa trắng đục hơn, mép mọc không đều. Khó phân biệt các vòng ngoài và trong. Hệ sợi nấm Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 32 STT Kí hiệu chủng Đặc điểm hình thái của các chủng nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 13 T6 Khuẩn lạc lớn, màu trắng ngà, ở giữa trắng đục hơn, mép không đều, có hình bông hoa. Sợi nấm ngắn và mỏng, không giọt tiết, không tiết sắc tố. 14 T7 Khuẩn lạc màu trắng, mép không đều, mọc thành 3 vòng rõ ràng, vòng giữa sợi nấm mọc dày. Mặt dưới có màu vàng. Hệ sợi nấm phát triển chậm trên môi trường và không tiết sắc tố. 15 T8 Khuẩn lạc màu trắng, ở giữa có màu đen, có các sợi bông ngắn và nổi li ti. Mặt dưới khuẩn lạc màu đen. Hệ sợi nấm phát triển nhanh trên môi trường và không tiết sắc tố. 16 T9 Khuẩn lạc màu xanh rêu hơi đen, sợi mảnh. Mép khuẩn lạc tròn đều và có màu trắng. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 17 T10 Khuẩn lạc màu trắng, sợi bông dày, mép tròn đều. Khuẩn lạc tạo thành 2 vòng tròn đồng tâm, vòng trong sợi nấm mọc dày hơn. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. 18 T11 Khuẩn lạc màu trắng đục, sợi nấm mọc dày. Mặt dưới có màu rêu hơi đen. Hệ sợi nấm phát triển chậm trên môi trường và không tiết sắc tố. 19 T12 Khuẩn lạc trắng, sợi nấm ngắn, ở giữa và mép màu hơi vàng. Khuẩn lạc tròn đều, không có giọt tiết, không tiết sắc tố. 20 L1 Khuẩn lạc màu trắng, sợi ngắn, mọc dày, ở giữa khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường thạch tạo thành các rãnh. Mặt dưới màu vàng cam. Hệ sợi nấm không giọt tiết, không tiết sắc tố. Từ kết quả thu được ở bảng 1 chúng tôi nhận thấy, sự phân bố của nấm nội sinh trên các bộ phận rễ, thân, lá của cây Đước bộp (R. mucronata Lam.) là khác nhau. Tổng số lượng nấm nội sinh phân lập ở thân nhiều hơn so với ở lá và rễ. Trong đó các chủng nấm nội sinh phân bố nhiều nhất ở mẫu thân chiếm 60%, mẫu rễ chiếm 35% và mẫu lá chiếm 5% tổng số nấm nội sinh phân lập được. Như vậy, chúng tôi thấy rằng nấm nội sinh có thể được tìm thấy ở tất cả các bộ phận của thực vật và ở các bộ phận khác nhau thì sự phân bố của nấm nội sinh cũng khác nhau. Sau khi các chủng nấm nội sinh được thuần khiết, chúng tôi tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các chủng nấm này. 3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của một số chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Đước bộp R. mucronata Các chủng nấm nội sinh phân lập được từ các mẫu rễ, thân, lá của cây Đước bộp (R. mucronata) được nuôi cấy trên môi trường khoai tây trong thời gian 4 ngày. Sau đó dùng khoan đục một lát thạch kích thước (0,5 x 0,5 cm) và cho vào bình tam giác 250 Năm học 2016 - 2017 33 ml chứa 150 ml môi trường khoai tây lỏng để tạo dịch lên men. Sau 7 ngày, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng oxy hóa dịch lên men của các chủng nấm này bằng cách rút 100 μl dịch lên men và sau đó xác định hoạt tính kháng oxy hóa của dịch lên men bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH. Chứng âm sử dụng là ethanol. Kết quả được thể hiện qua các bảng 2. Bảng 2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của các chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Đước bộp STT Chủng HTKOH (%) 1 R1 - 2 R2 29,913b ± 9,206 3 R3 - 4 R4 15,652a ± 7,609 5 R5 - 6 R6 - 7 R7 - 8 T1 10,261a ± 11,405 9 T2 - 10 T3 - 11 T4 39,652b ± 2,270 12 T5 - 13 T6 - 14 T7 - 15 T8 66,957c ± 3,832 16 T9 - 17 T10 32,174b ± 3,170 18 T11 6,453a ± 1,546 19 T12 - 20 L1 - Chú thích: a<b<c sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Qua bảng 2, chúng tôi nhận thấy rằng trong số 20 chủng nấm nội sinh phân lập được từ cây Đước bộp thì chỉ có 7/20 chủng có hoạt tính kháng oxy hóa chiếm 35% và 13/20 chủng không thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa chiếm 65% trong tổng số các chủng nấm phân lập được. Trong 7 chủng có HTKOH thì chủng T8 thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất (%HTKOH = 66,957 ± 3,832), chủng T11 thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa yếu nhất (%HTKOH = 6,453 ± 1,546). Như vậy, dựa vào tỉ lệ phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa của dịch lên men chủng T8 (%HTKOH = 66,957%) cho thấy chủng nấm này có rất nhiều tiềm năng trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa. Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 34 3.3. Đặc điểm sinh học của chủng nấm đã tuyển chọn Để làm cơ sở cho những nghiên cứu hướng tới ứng dụng tiếp theo, việc định danh đến loài chủng nấm T8 là hết sức cần thiết. Kết quả định danh cho phép chúng tôi có cơ sở để tiếp cận với các dữ liệu về đặc điểm sinh lí, sinh hóa và các nghiên cứu đã công bố của chủng nấm này. Chính vì vậy, chúng tôi gửi chủng nấm T8 đến Công ti xét nghiệm Nam khoa giải trình tự gen vùng ITS, kết quả như sau: Trình tự gen vùng ITS của chủng T8 được so sánh với ngân hàng gen NCBI. Kết quả cho thấy chủng T8 thuộc loài Daldinia eschscholtzii. Chủng nấm D. eschscholtzii được nuôi cấy trong môi trường khoai tây và mô tả các đặc điểm hình thái đại thể và vi thể. Kết quả được thể hiện qua hình 1, hình 2. Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Hình 1. Khuẩn lạc của chủng D. eschscholtzii qua 7 ngày quan sát Hình 2. Quan sát vi thể chủng D. eschscholtzi Đặc điểm đại thể: Khuẩn lạc màu trắng, ở giữa có màu đen, có các sợi bông ngắn và nổi li ti. Mặt dưới khuẩn lạc màu xám đen, hệ sợi nấm phát triển nhanh trên môi trường và không tiết sắc tố. Năm học 2016 - 2017 35 Đặc điểm vi thể: Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn dày, không màu. Bào tử trần đính trên các thể bình, cuống bào tử phình to rõ rệt ở phần đầu tạo thành bọng lớn dạng hình cầu. 3.4. Khảo sát hoạt tính kháng oxy của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii 3.4.1. Kết quả tạo cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii Chủng D. eschscholtzii được nuôi lắc trên môi trường khoai tây lỏng với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày. Sau đó dịch lên men được chiết xuất 2 lần với dung môi ethyl acetate tỉ lệ 1:1 về thể tích. Dịch chiết với dung môi ethyl acetate được gộp lại và cô quay để loại bỏ dung môi. Sau đó, cao ethyl acetate được để ở nhiệt độ phòng cho bay hơi hết phần dung môi còn lại và thu được cao khô. Chúng tôi sử dụng 1,5 lít dịch lên men và đã chiết xuất được 0,32 g cao khô. 3.4.2. Phần trăm bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii. Cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii được pha loãng thành các nồng độ từ 100 µg/ml đến 1000 µg/ml. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chứng âm sử dụng là ethanol. Kết quả tỉ lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii được thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. Tỉ lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii Nồng độ (μg/ml) %HTKOH 0 0,000a ± 0,000 100 3,125a ± 2,122 200 18,403b ± 5,717 300 30,556c ± 5,847 400 38,542d ± 1,532 500 40,278d ± 2,696 600 49,479e ± 1,727 700 52,951e,f ± 2,189 800 59,028f ± 3,580 900 75, 694g± 2,118 1000 81,076g ± 6,733 IC50 = 615,408 (μg/ml) a<b<c<d<e<f<g: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết quả thu được ở bảng 3, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii tăng theo nồng độ mẫu. Cụ thể là, khi tăng nồng độ mẫu từ 100 μg/ml lên 1000 μg/ml thì tỉ lệ phần trăm Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 36 HTKOH tăng dần từ 3,125 % đến 81,076 %. Điều này chứng tỏ HTKOH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii tăng dần theo chiều tăng nồng độ mẫu. Chúng tôi xác định được giá trị IC50 trong phương pháp bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii là 615,408 (μg/ml). Năm 2015, Dilusha Fernando và cộng sự đã tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH của các chủng nấm phân lập được từ khu bảo tồn rừng ở Sri Lanka. Trong đó, nhóm tác giả đã xác định được giá trị IC50 cao methanol chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii là 735,77 (μg/ml) [6]. So với kết quả nghiên cứu của chúng tôi thì giá trị IC50 của cao ethyl acetate thấp hơn so với cao methanol chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii. 3.4.3. Phần trăm bẫy thử nghiệm MDA của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii Cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii được pha loãng thành các nồng độ từ 100 µg/ml đến 1000 µg/ml. Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, chứng âm sử dụng là methanol. Kết quả tỉ lệ phần trăm trong thử nghiệm MDA của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii được thể hiện ở bảng 4. Bảng 4. Tỉ lệ phần trăm thử nghiệm MDA của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii Nồng độ (μg/ml) %HTKOH 0 0a ± 0,000 100 4,918b ± 9,303 200 8,197b ± 8,336 300 14,754b,c ± 3,596 400 16,393b,c ± 11,145 500 26,23c ± 3,904 600 27,869c ± 1,596 700 45,902d ± 2,284 800 50,82d ± 12,232 900 72,131e ± 5,648 1000 83,607e ± 5,778 IC50 = 723,95 (μg/ml) a<b<c<d<e: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết quả thu được ở bảng 4, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ phần trăm xác định hàm lượng MDA của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii tăng theo nồng độ mẫu. Cụ thể là, khi tăng nồng độ mẫu từ 100 μg/ml lên 1000 μg/ml thì tỉ lệ phần trăm HTKOH tăng dần từ 4,918% đến 83,607%. Điều này chứng tỏ HTKOH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii tăng dần theo chiều tăng của nồng độ mẫu. Chúng tôi xác định được giá trị IC50 trong phương pháp xác định hàm lượng MDA của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii là 723,95 (μg/ml). Năm học 2016 - 2017 37 Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2009) đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng oxy in vitro của cao nước và cao cồn chiết xuất từ nấm Linh chi đỏ bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH và phương pháp xác định hàm lượng MDA. Kết quả đã xác định được giá trị IC50 của cao nước và cao cồn chiết xuất từ nấm Linh chi đỏ bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH lần lượt là: 1708; 1326 μg/ml và phương pháp xác định hàm lượng MDA lần lượt là: 2818; 1368 μg/ml [4]. Như vậy, so với kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy giá trị IC50 của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng D. eschscholtzii khi khảo