Phân loại sinh học phân tử

SEMINAR NGUYÊN TẮC PHÂN LOẠI SINH VẬT LỚP K53A - SINH HỌC PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Trung Thành Sinh viên thực hiện: Đào Trọng Khoa Hoàng Thị Xoan Phan Hồng Anh Trần Văn Hiếu NỘI DUNG CHÍNH I. TỔNG QUAN VỀ PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ 1.1. ĐỊNH NGHĨA SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, gồm quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp DNA, RNA, Protein và cách thức điều hòa các mối tương tác này. 1.2. PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ Là phương pháp phân loại sinh vật bằng đặc điểm gen ở mức độ phân tử. Tức là phân loại bằng các dẫn liệu so sánh hóa sinh các phân tử lớn như DNA, RNA, protein. Hiện nay phân loại sinh học phân tử đã và đang trở thành khoa học mũi nhọn trong phân loại học, bổ sung cho phân loại học truyền thống những phương pháp nghiên cứu mới và một loại đặc điểm phân loại hoàn toàn khác với những đặc điểm phân loại đã̃ dùng trước đây. II. CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ 2.1. SO SÁNH PROTEIN Số liệu so sánh Protein là một đăc điểm phân loại quan trọng, đáng tin cậy để xác định quan hệ giữa các taxon sinh vật, kể cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn. Có nhiều phương pháp so sánh Protein. Nguyên lý: Protein của một loài sinh vật có phản ứng kháng thể đối với protein của một loài có quan hệ gần mạnh hơn đối với protein của loài có quan hệ xa hơn. Phương pháp này được áp dụng để kiểm tra một số kết quả phân loại theo đặc điểm hình thái và các đặc điểm phân loại khác. Kỹ thuật nghiên cứu định lượng phản ứng kháng thể. VD: phương pháp cố định vi bổ thể lượng (microcomplement faxation) do Champion đề xướng. Hiện nay, phương pháp xác định và so sánh trình tự acid amin của các protein có cùng chức năng là phương pháp trực tiếp và được sử dụng rộng rãi nhất. Số liệu so sánh trình tự cytochrome, các protein vận chuyển điện tử (electron transport protein), trình tự các histone, các protein sốc nhiệt, protein phiên mã, dịch mã được dùng rất phổ biến trong phân loại học. Một số phương pháp so sánh gián tiếp: Phương pháp điện di Kỹ thuật miễn dịch học so sánh kháng thể Kỹ thuật điện di enzyme đa locut 2.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI Trước đây, trong kỹ thuật nghiên cứu hóa sinh, kỹ thuật sắc ký (chromatographic mathods) được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên hiện nay trong nghiên cứu sinh học phân tử, phương pháp sắc ký được thay thế bằng phương pháp điện di (electrophoresis). 2.2.1. KỸ THUẬT ĐIỆN DI Các bước chính của kỹ thuật điện di: Đặt gel điện di đã nạp vật mẫu nghiên cứu vào dung dịch đệm của môi trường điện di có độ pH thích hợp. Cho dòng điện một chiều chạy qua môi trường điện di. Trong điều kiện nhiêt độ thích hợp, thời gian thích hợp các cấu tử điện di (các phần tử tích điện) sẽ di chuyển trên giá thể điện di hay bản gel điện di với tốc độ khác nhau, tạo thành phổ băng điện di. Sau khi bản gel được nhuộm màu bằng thuốc nhuộm thích hợp, ta có thể quan sát phổ băng điện di dưới kính hiển vi quang học, hoặc chụp ảnh với độ phóng đại cần thiết. Kết quả phân tích cuối cùng được thể hiện bằng biểu đồ hình cây (dendrogram - cây nguồn gốc chủng loại). VIDEO 2.2.2. ĐIỆN DI GEL TRƯỜNG ĐIỆN XUNG Là dạng cải tiến của kỹ thuật điện di. Hạn chế cơ bản của kỹ thuật điện di là không có khả năng phân tách vật mẫu có kích thước phân tử lớn. Hạn chế này đã được khắc phục bằng kỹ thuật gel trường điện xung (PFGE = pulssed field gel electrophoresis) là một dạng cải tiến của kỹ thuật điện di. Thủ pháp chính của kỹ thuật PFGE là: đổi chiều dòng điện chạy qua gel điện di, gây xung điện theo chu kỳ. Ưu điểm: kỹ thuật PFGE có khả năng phân tách theo kích thước những đoạn DNA kích thước tới vài megabase. Với ưu điểm vượt trội trên, hiện nay kỹ thuật PFGE được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hóa sinh và công nghệ sinh học. 2.3. PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH DNA Gồm có các phương pháp chính sau: So sánh thành phần base hữu cơ của nucleic acid. Lai DNA/DNA. Lai DNA/RNA. Phân tích các đoạn DNA cắt giới hạn (REA) Kỹ thuật thấm tách Southern. 2.3.1. SO SÁNH THÀNH PHẦN BASE HỮU CƠ CỦA NUCLEIC ACID Đây là phương pháp so sánh DNA được sử dụng đầu tiên và có thể cũng là phương pháp đơn giản nhất. Phương pháp này dựa trên tỷ lệ (G+C)/(A+T) hoặc thành phần G+C trong DNA: Mol% G+C = Số liệu so sánh tỷ lệ G+C là đặc điểm phân loại đáng tin cậy để kiểm tra kết quả phân loại bằng những loại đặc điểm khác. Tỷ lệ G+C cũng là đặc điểm phân loại tin cậy để xác định các chi, thường là các chi sinh vật nhân sơ. Xác định thành phần base hữu cơ của DNA qua nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA. Tm là nhiệt độ làm 50% sợi kép tách thành sợi đơn. 2.3.2. LAI DNA/DNA Có thể so sánh trực tiếp các nguồn gen khác nhau của sinh vật nhờ phương pháp lai DNA. Mức độ lai của những đoạn DNA sợi đơn từ những nguồn khác nhau biểu thị mức độ giống nhau của các sinh vật mang các nguồn gen đó. Phương pháp này chỉ có thể áp dụng để so sánh và phân biệt với những sinh vật có quan hệ gần. Phản ứng lai của những đoạn DNA sợi đơn của 2 nguồn gene khác nhau có thể xảy ra ngay cả khi trình tự nucleotide của 2 nguồn gene khác nhau 15%. Những nucleotide không ghép cặp bổ sung sẽ làm cho sợi kép lai kém bền và sẽ tách thành 2 sợi đơn ở Tm thấp. Trong điều kiện tối ưu, nếu mức độ lai DNA của 2 nguồn gene thí nghiệm đạt từ 70 – 100%, Tm của sợ kép lai giảm dưới 5% thì 2 nguồn gene là của cùng một loài. 2.3.3 LAI DNA/RNA Phương pháp này cho phép so sánh và phân biệt nguồn gene của những sinh vật thuộc các taxon khác nhau có quan hệ xa. Trong phép lai DNA/RNA sử dụng r-RNA hoặc t-RNA. Kỹ thuật lai cũng gồm có các khâu cơ bản tương tự như lai DNA/DNA. Kỹ thuật lai DNA/DNA và DNA/RNA không ngừng được cải tiến. Hiện nay có khá nhiều kỹ thuật lai. Thường dùng là phương pháp lai với mẫu dò: sử dụng đoạn DNA tổng hợp nhân tạo có trình tự ngắn(20-30 Nu) làm mẫu dò. lai với mẫu dò trong pha rắn (solid phase hybridization) lai với mẫu dò trong pha lỏng (solution phase hybridization) lai tại chỗ (in situ hybridization) Lai với mẫu dò trong pha rắn (Solid phase hybridization): nucleic acid đối tượng nghiên cứu được gắn vào màng nylon hoặc màng nitrocellulose để lai với mẫu dò đặc hiệu. Lai với mẫu dò trong pha lỏng (solution phase hybridization): yếu tố bảo đảm cho kết quả phản ứng là các mẫu dò DNA trình tự ngắn không tự lai với nhau. Lai tại chỗ (in situ hybridization): nguyên lý cơ bản giống như phép lai trong pha rắn hoặc pha lỏng, nhưng phản ứng lai xảy ra trong mô tế bào bị nhiễm. 2.3.4. PHÂN TÍCH CÁC ĐOẠN DNA CẮT GIỚI HẠN (REA) Là kỹ thuật sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt sợi DNA đối tượng nghiên cứu thành những đoạn nhỏ, sau đó phân tích số lượng và kích thước các đoạn cắt giới hạn bằng kỹ thuật điện di gel agaroza. Enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme hay endonucleaza) là những enzyme cắt DNA ở điểm trình tự đặc biệt thành những đoạn ngắn 4 – 8 nucleotide. Tên các enzyme cắt giới hạn được viết tắt theo tên loài vi khuẩn có enzyme đó. Các loại enzyme cắt giới hạn gồm 3 typ: Typ I và II cắt DNA ở các điểm trình tự nhận biết Typ III cắt DNA ở vị trí trình tự nhận biết đặc biệt. Ưu điểm: kỹ thuật REA không phức tạp, tương đối dễ tiến hành và có thể lặp lại cho kết quả giống nhau, bảo đảm độ chính xác và đáng tin cậy. Nhược điểm: khó phân tích và so sánh kết quả vì số lượng sản phẩm cắt lớn, phổ băng điện di nhiều khó phân biệt Ứng dụng: dùng phổ biến trong phân loại vi sinh vật nhân thật và sinh vật nhân sơ để xác định các dòng chuẩn cũng như là một trong những kỹ thuật hay dùng trong thực tiễn dịch tễ học để phân biệt và xác định các dòng vi sinh vật như vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm. 2.3.5. KỸ THUẬT THẤM TÁCH SOUTHERN Phương pháp tương tự kỹ thuật REA nhưng không phân tích tất cả các đoạn gen DNA cắt giới hạn mà chỉ phân tích chọn lọc những đoạn có liên quan đến một số locut nhiễm sắc thể đặc biệt. Số lượng và kích thước các đoạn DNA lai được gọi là đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP = restrict fragment length polymorphism) Vấn đề lựa chọn mẫu dò có ảnh hưởng quyết định đến kết quả phân tích Southern. Kỹ thuật này được áp dụng khá phổ biến trong thực tiễn dịch tễ học để phân biệt và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh, cho phép phân tích phát hiện tất cả các dòng vi khuẩn có locut tương đồng với mẫu dò. Áp dụng để phân tích những gene mã hóa các độc tố và chức năng trao đổi chất để xác định các dòng phân lập. 2.4. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA Phương pháp phân tích trình tự DNA ưa chọn hiện nay là phương pháp Sanger. Phương pháp này sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) trong phản ứng tổng hợp DNA. Kết quả phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra những đoạn DNA ngắn đặc trưng dễ phân tích. Thủ pháp cơ bản: trong quá trình phản ứng tổng hợp DNA, khi chuỗi đang tiếp tục kéo dài, đưa ddNTP gắn vào chuỗi DNA ở đầu mà phản ứng đang tiếp tục, thế chỗ cho deoxynucleotide làm ngừng phản ứng xúc tác của DNA polymerase. Phương pháp Sanger sử dụng mồi oligonucleotide tổng hợp nhân tạo có thể tiến hành thủ công hoặc bằng máy phân tích tự động. Phương pháp thủ công Phân tích trình tự DNA bằng máy tự động Kỹ thuật phân tích trình tự DNA phát triển nhanh chóng và không ngừng được cải tiến. Nguồn dữ liệu cơ bản về bộ gen các sinh vật (ngân hàng gen) không ngừng được tăng nhanh. Một trong những ngân hàng gen lớn nhất hiện nay là International Nucleic Acid Sequence Data Library 2.5. PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ r-RNA r-RNA là thành phần cơ bản chủ yếu có chức năng giống nhau trong tất cả các loại ribosome. Cấu tạo r-RNA biến đổi chậm trong quá trình tiến hóa, trình tự nucleotide của r-RNA đa dạng, ổn định. Vì vậy phân tích và so sánh trình tự nucleotide của r-RNA cung cấp những bằng chứng khách quan tin cậy làm cơ sở để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài, giữa các taxon bậc trên loài. 2.5.1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ r-RNA TỔNG THỂ Các bước tiến hành gồm có: Phân lập và làm tinh khiết r-RNA. Dùng enzyme mã ngược và mồi oligonucleotide ghép cặp bổ sung với trình tự của r-RNA để chuyển r-RNA thành DNA bổ sung. Nhân bội cDNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Phân tích trình tự sản phẩm PCR thep phương pháp Sanger bằng máy phân tích tự động như phương pháp phân tích trình tự DNA. Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu bệnh học và dịch tễ học để phân tích xác định các dòng vi khuẩn trong tự nhiên và cả những vi khuẩn gây bệnh không thể nuôi cấy lại trong phòng thí nghiệm, cung cấp những dữ liệu khách quan và chính xác cho các nghiên cứu định lượng tiếp theo. Các đặc điểm nghiên cứu r-RNA là nguồn đặc điểm phân loại làm cơ sở cho việc phân tích, đánh giá quan hệ tiến hóa giữa các nhóm loài sinh vật nhân thật bậc thấp và sinh vật nhân sơ. 2.5.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT ĐOẠN TRÌNH TỰ r-RNA NGẮN, ĐẶC TRƯNG Các bước chính: + phân lập và làm tinh khiết r-ARN 16S, gắn chất phóng xạ hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang + dùng enzym cắt giới hạn ribonucleaza T1 cắt r-ARN 16S thành những đoạn ngắn + phân tách và sắp xếp các đoạn ngắn theo kích thước trên gel điện di + phân tích trình tự nucleotit của tất cả các đoạn từ 6 nucleotit trở lên + Kết quả phân tích trình tự ngắn của các sinh vật khác nhau được so sánh và tính hệ số tương đồng. Đoạn phân tử r-RNA 16S trong ribosome của hầu hết các sinh vật nhân sơ cũng như nhân thật thường có một hay nhiều đoạn trình tự ngắn đặc trưng cho từng loài hoặc nhóm loài, gọi là trình tự chữ ký ngắn. Kết quả phân tích so sánh trình tự những đoạn đó là đặc điểm chẩn loại làm căn cứ định loại chính xác và sắp xếp các loài, các nhóm sinh vật vào các taxon thích hợp. Cây phát sinh chủng loại của sinh giới theo quan điểm của Carel Woese (1993) dựng theo số liệu phân tích, so sánh trình tự r-RNA 16S 2.6. KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật hiệu năng cao đã và đang được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử. Nguyên lý: dựa trên khả năng xúc tác của enzyme DNA polymerase trong phản ứng kéo dài đoạn trình tự bổ sung bắt đầu từ đoạn mồi trình tự ngắn gắn trên 2 sợi đơn của đoạn DNA khuôn để tạo phiên bản của đoạn DNA cần phân tích. Các thành phần thiết yếu tham gia phản ứng PCR Cặp mồi trình tự ngắn Đoạn DNA cần phân tích Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt 4 loại deoxyribonucleotide triphosphate 2.6.1. CHUỖI PHẢN ỨNG PCR Chuỗi phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: + Bước biến tính: tách những đoạn DNA sợi kép thành sợi đơn làm sợi khuôn để sao chép nhân bản. + Bước gắn mồi: cho các đoạn mồi (primer) lai ghép cặp bổ sung với 2 đoạn trình tự ở 2 đầu đoạn DNA sợi khuôn. + Bước tổng hợp: tiến hành phản ứng tổng hợp để tạo ra sợi DNA mới theo trình tự nucleotide của sợi khuôn. Sau mỗi chu kỳ 3 bước thì số lượng đoạn DNA được nhân gấp đôi. II. CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ VIDEO 2.6.2. CÁC CẢI TIẾN CỦA KỸ THUẬT PCR Kỹ thuật PCR luôn được đổi mới và cải tiến, cụ thể có những phương pháp cải tiến sau: + PCR mồi ngẫu nhiên (RADP) + Rep - PCR Kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn nhân bội (AFLP) Phân tích các đoạn cắt giới hạn sản phẩm PCR III. ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ Nhờ những nghiên cứu sinh học phân tử, nhiều ý tưởng, chương trình khoa học đã được xây dựng phục vụ đắc lực cho công tác phân loại sinh vật. Nổi bật là ý tưởng đồng hồ phân tử và mô hình cây nguồn gốc chủng loại. Ý tưởng về đồng hồ phân tử do Zuckerkandl và Pauling đề xuất (1965). Hoạt động của đồng hồ phân tử: Với giả thiết là tốc độ biến đổi của các phân tử là không đổi thì đồng hồ phân tử sẽ chạy khác nhau ở các loài khác nhau. Đồng hồ phân tử được chia độ theo niên đại của các điểm phân nhánh giữa các taxon bậc cao. Từ số liệu về niên đại các điểm phân nhánh đã tính được cùng với số lượng các acid amin khác nhau đã biết, tính số trung bình các acid amin được thay thế trong 10 triệu năm. 3.1. ĐỒNG HỒ PHÂN TỬ (MOLECULAR CLOCK) Tính năng của đồng hồ phân tử: Khung thời gian của đồng hồ phân tử cho phép xác định cây phát sinh chủng loại, phác họa giả thuyết về nguồn gốc chủng loại. Cho phép dự tính gần đúng thời gian phân ly và quan hệ của các nhánh tiến hóa. Mặt hạn chế của ý tưởng đồng hồ phân tử là ở chỗ độ tin cậy chưa cao. Điều này đươc giải thích bởi hai lý do: Giả định tốc độ biến đổi của các phân tử làm cơ sở cho đồng hồ phân tử là không đáng tin cậy. Ý tưởng về đồng hồ phân tử được đề xuất trước khi phát triển kỹ thuật phân tích trình tự DNA và RNA. 3.2. CÂY NGUỒN GỐC CHỦNG LOẠI (PHYLOGENETIC TREES) Cây nguồn gốc chủng loại: là đồ thị hình cây, phân nhánh để minh họa giả thuyết về nguồn gốc chủng loại của sinh vật. 3.2.1. MÔ HÌNH CÂY NGUỒN GỐC CHỦNG LOẠI Mô hình cây phát sinh chủng loại là dạng đồ thị hình cây phân nhánh theo kiểu lưỡng phân: các nhóm lớn tách đôi thành 2 nhóm nhỏ, mỗi nhóm nhỏ lại tách đôi thành 2 nhóm nhỏ hơn và tiếp tục cho đến loài là bậc phân loại thấp nhất. Đồ thị gồm các điểm biểu thị các taxon, nối với nhau bằng các nhánh,tạo thành dạng đồ thị hình cây, các điểm ở đầu mút của các nhánh đại diện các taxon hiện đang sống. Các nhánh giữa hai điểm là những đoạn thẳng, đồ thị không có đường song song. 3.2.2. CÁC DẠNG CÂY NGUỒN GỐC CHỦNG LOẠI Có hai dạng cây phát sinh chủng loại: + Dạng cây không có gốc, chỉ đơn thuần hiển thị mức độ giống nhau không hiển thị nguồn gốc chung của các taxon nghiên cứu (phenogram). + Dạng cây hiển thị cả quan hệ tiến hóa và nguồn gốc chung của các taxon (cladogram). Phenogram Cladogram 3.2.3. MỘT SỐ CHƯƠNG TRÌNH SỬ DỤNG ĐỂ DỰNG CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOẠI Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều chương trình phần mềm máy tính để dựng cây phát sinh chủng loại đã được công bố và không ngừng được hoàn thiện. Một số chương trình thường gặp trên các tài liệu phân loại sinh học phân tử: Chương trình NTSYS: sử dụng phương pháp phân tích cụm theo nguyên tắc liên kết trung bình cộng. Chương trình PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony): phân tích giả định nguồn gốc chủng loại theo nguyên tắc ngắn gọn. Chương trình Maximum-likelihood Estimation trên cơ sở giả định: quá trình tiến hóa của sinh vật theo một mô hình ngẫu nhiên đơn giản. Chương trình PHYLIP (Phylogeny Inference Package). Chương trình HENNIG-86. 3.2.4. KHÓ KHĂN CỦA VIỆC SỬ DỤNG CÂY NGUỒN GỐC CHỦNG LOẠI Việc sử dụng cây nguồn gốc chủng loại để minh họa cho các kết quả nghiên cứu gặp một số khó khăn cơ bản về lý thuyết và thực nghiệm: cùng một nguồn dẫn liệu nhưng sử dụng các chương trình máy tính khác nhau, sẽ dựng được nhiều cây phát sinh chủng loại khác nhau, và chưa có nhà phân loại học nào phân tích để xác định xem chương trình nào là tốt nhất, kể cả việc lựa chọn cây nào trong số đó cũng là một khó khăn. IV. GIÁ TRỊ PHÂN LOẠI HỌC CỦA CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ Các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử đã bổ sung cho phân loại học sinh vật một loại đặc điểm phân loại hoàn toàn khác với tất cả các đặc điểm đã dùng trong phân loại học truyền thống. Phân loại sinh học phân tử có khả năng phát hiện những sai lầm, những điểm chưa hợp lý trong phân loại học truyền thống. Các kết quả nghiên cứu của sinh học phân tử cung cấp những thông tin khách quan có độ tin cậy cao, giúp giải quyết những khó khăn mà phân loại học truyền thống không giải thích được. Các số liệu phân tích và so sánh protein là những đặc điểm phân loại có giá trị được sử dụng cả trong phân loại vi mô và phân loại vĩ mô. Nhiều kỹ thuật phân tích protein được áp dụng để phân loại và xác định các loại nguồn gốc chủng loại của sinh vật kể cả nhân sơ và nhân chuẩn.