Các phương pháp phân tích ADN

Các phương pháp phân tích ADN PGS.TS. Trần Cát Đông * Chiết tách vật liệu di truyền Nguyên tắc chung: 3 bước Phá vỡ tế bào: vật lý, hóa học Chiết tách acid nucleic: Phenol-Chloroform Kết tủa acid nucleic: cồn tuyệt đối Các trường hợp cụ thể: Plasmid: mục tiêu loại NST bằng sự khác nhau về cấu dạng - kích thước ADN thực khuẩn: tủa phage bằng PEG, loại bỏ capsid Tế bào Thực vật: phá tế bào bằng cách nghiền Tế bào Động vật: phá tế bào bằng enzym - chất tẩy ARN: bất hoạt RNase, tủa bằng LiCl 8M, loại ADN bằng DNase Tủa lượng ADN nhỏ: độn bằng tARN Tủa bằng isopropanol, tert-butanol,… Các kỹ thuật khác Loại carbohydrat, lipid bằng CTAB Thu hồi ADN bằng sắc ký hấp phụ * Tinh chế acid nucleic Siêu ly tâm, ly tâm phân đoạn Gradient liên tục / không liên tục của cesium chloride (CsCl) Gradient saccharose Sắc ký Sắc ký ái lực: sử dụng pha tĩnh là U-Sepharose hay oligodT- cellulose để tinh chế mARN. Sắc ký lọc gel để tách các nucleotid tự do sau khi tạo mẫu dò đánh dấu. Sắc ký trao đổi ion trên vi cột, áp dụng để thu hồi những lượng ADN rất nhỏ. Sắc ký lỏng hiệu năng cao: dùng để tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ phân giải là 1 nucleotid), plasmid, phân tách các đoạn ADN. Điện di: Agarose PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) * Định tính - định lượng acid nucleic Quang phổ kế: OD260nm 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base) Kiểm tra độ tinh khiết bằng tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280, OD320nm Điện di gel: phân tách acid nucleic bằng dòng điện trong gel Định tính theo kích thước Định lượng bằng so sánh với chuẩn * Điện di * Các enzym biến đổi acid nucleic Enzym cắt hạn chế / methylase Cắt ADN tại vị trí xác định Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù Lưu ý tính tương thích khi cắt nối Polymerase ADN polymerase phụ thuộc ADN Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu ARN polymerase phụ thuộc ADN Ligase Nối hai đoạn ADN Nối được Nối được Không được * Kỹ thuật lai acid nucleic Là sự bắt cặp bổ sung đặc hiệu của hai phân tử acid nucleic mạch đơn G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T + Các yếu tố ảnh hưởng Nồng độ ADN và thời gian phản ứng Nhiệt độ Độ dài của các trình tự Lực ion * Kỹ thuật lai acid nucleic Southern Blot: lai ADN Northern Blot: lai ARN Lai tại chỗ (in situ) Mẫu dò (probe) Hệ thống phát hiện Phóng xạ Enzym Huỳnh quang * Kỹ thuật PCR Nguyên lý: sao chép ADN in vitro Trong điều kiện có sẵn nucleotid Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’-OH trống Kỹ thuật PCR gồm 3 bước: biến tính dsADN thành các sợi đơn nhờ nhiệt độ, ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN, enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu. 3’-OH 5’-P * PCR * PCR - Các yếu tố kỹ thuật Chương trình PCR Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần Biến tính: 94-95oC / 30’-vài phút Gắn mồi: 40-70oC (C: NaOH 1,2N/90oC cắt ADN ở Adenin > Cytosin Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự * Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert * * Phương pháp giải trình tự Maxam và Gilbert * Ưu nhược điểm của Maxam-Gilbert Ưu: Giải trình tự không cần mồi Nhược: Chậm Độc hại Năng suất thấp Không tự động hóa được * Pyrosequencing Được phát triển bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi tại Royal Institute of Technology, Thụy Điển, năm 1996 Dựa vào phát hiện sự phóng thích pyrophosphate khi nucleotide được gắn vào Thành phần phản ứng: ADN sợi đơn Mồi Các enzym: DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase, Các cơ chất adenosine 5´ phosphosulfate (APS) và luciferin